从小鼠胼胝下区分离与培养成年神经干细胞

从置于冰冷脑组织切片模具上的小鼠脑组织开始。

获取包含胼胝下区（SCZ）的切片。将切片转移至冰冷的磷酸盐缓冲液中。

在解剖显微镜下，切出 SCZ 区域。

将解剖得到的SCZ切成更小的片段。

将这些组织块转移至消化缓冲液中，孵育以使细胞从组织中解离出来。

离心并弃去上清液。用适当的培养基重新悬浮细胞。

将细胞转移至培养板，并加入特定生长因子。

成年神经干细胞分裂，形成称为神经球的细胞簇。

细胞簇中营养物质分布不均限制了细胞生长。

为分散细胞团簇，先进行离心并弃去上清液。将细胞团簇重悬于解离缓冲液中，并进行孵育。

用移液器反复吹打溶液以获得单细胞。

离心并弃去上清液。

重悬细胞并将其转移至合适的培养基中，以获得单层细胞。

解剖后，将小鼠脑转移至冰冷的PBS缓冲液中，清洗两次以去除多余的血液。接着，将脑组织置于冰上的脑切片模具中，进行冠状面切割，获得厚度为1毫米的脑片。随后，将包含SCZ区域的后部脑片转移至冰冷的PBS中。

在低倍解剖显微镜下，使用弯头30号针头从大脑皮层和海马的白质区域显微解剖分离SCZ。随后，去除SCZ上方的皮层组织，将分离出的SCZ置于冰上盛有冷PBS的35毫米培养皿中。

利用脑组织切片矩阵和弯曲的30号针头，可以从整个组织中精确分离出胼胝体下区。

随后，移除 PBS，立即将已解剖的组织切成小块。用一毫升消化缓冲液重悬组织碎片。然后，将样品转移至含有两毫升消化缓冲液的 15 毫升离心管中。接着，在 37 摄氏度水浴中孵育 30 分钟。

在此步骤中，轻轻敲击试管以分散已消化的组织，然后在145 × g条件下离心试管 g 5分钟后，弃去上清液，用1毫升预热的DMEM/F12培养基重悬消化后的组织，以洗去消化液，并轻轻吹打样品溶液最多5次。

随后，再次以145 × g 离心样品5分钟。弃去上清液后，将细胞沉淀重悬于1毫升N2培养基中。在未经包被的六孔板中加入1毫升N2培养基，再加入1毫升重悬的细胞，终体积为2毫升。

接下来，向每个孔中加入20 纳克/毫升 EGF 和 20 纳克/毫升 bFGF。用手轻轻晃动六孔培养板，使加入的生长因子与接种的细胞充分混匀。然后，将六孔板置于37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育。

每天向每个孔中加入 20 纳克/毫升 EGF 和 20 纳克/毫升 bFGF，持续八天。每三天添加 200 微升 N2 培养基，以维持培养基体积约为 2 毫升。以下是培养八天后的神经球图像。

在此步骤中，收集神经球并转移至新的15毫升离心管中。以145 × g离心该管 g 5分钟后，弃去上清液，用0.5毫升解离缓冲液重悬神经球。将神经球在37摄氏度水浴中与0.5毫升解离缓冲液孵育5分钟，以将其解离为单细胞。

轻轻吹打样本溶液，上下吹打不超过五次，然后以145 × g离心管子 g 五分钟。随后弃去上清液，用一毫升 N2 培养基重悬神经球。将六孔板用 PLL 层粘连蛋白包被后，以 2.5 x 10⁵ 每毫升细胞用每孔2毫升N2培养基悬浮。在传代前，每天添加生长因子，持续培养SCZ成体神经干细胞5天。