从小鼠胼胝体下区分离和培养成体神经干细胞

从冷冻大脑基质上的小鼠大脑开始。

获取包含胼胝体下区或SCZ的切片。将切片转移到冷磷酸盐缓冲液中。

在解剖显微镜下，切出SCZ部分。

解剖的SCZ切成小块。

将这些碎片转移到消化缓冲液中。孵育以将细胞与组织解离。

心并丢弃上清液。将细胞重悬于合适的培养基中。

细胞转移到培养板中并添加特定的生长因子。

成体神经干细胞分裂，形成称为神经球的簇。

细胞簇中营养分布不当会限制细胞生长。

要分散簇，请离心并丢弃上清液。将簇重悬于解离缓冲液中并孵育。

上下移液溶液以生成单细胞。

心并丢弃上清液。

悬细胞并将它们转移到合适的培养基中以获得单层。

解剖后，将小鼠大脑转移到冷的PBS缓冲液中，并冲洗两次以去除多余的血液。接下来，将大脑放在冰上的大脑基质中，并进行冠状切割以获得一毫米厚的切片。随后，将含有SCZ区域的后脑切片转移到冷PBS中。

在低放大倍率的解剖显微镜下，用弯曲的30号针头从皮质和海马体的白质区域显微解剖SCZ。然后，去除SCZ上方的皮层区域，并将解剖的SCZ放入冰上的35毫米培养皿中的冷PBS中。

脑基质和弯曲的 30 号针头可以从整个组织中精确解剖胼胝体下区域。

之后，取出PBS，然后立即将解剖的组织切成小块。用一毫升消化缓冲液重悬它们。然后，将样品转移到含有两毫升消化缓冲液的 15 毫升管中。然后，将其在 37 摄氏度的水浴中孵育 30 分钟。

在此步骤中，轻轻敲击试管以解离消化的组织，然后将试管以 145 倍 g 离心五分钟。五分钟后，弃去上清液，用一毫升预热的培养基和两份培养基重悬消化的组织以洗掉消化缓冲液，然后轻轻移液样品溶液最多五次。

接下来，再次以 145 倍 g 离心样品五分钟。弃去上清液后，将细胞沉淀重悬于一毫升 N2 培养基中。将一毫升N2培养基放入未包被的六孔板中，并加入一毫升悬浮细胞，使最终体积为两毫升。

接下来，向每个孔中加入每毫升 EGF 20 纳克和每毫升 bFGF 20 纳克。用手轻轻摇动六孔培养皿，将添加的生长因子与接种的细胞混合。然后，将六孔板保存在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的培养箱中。

每天向每个孔中添加 20 纳克每毫升 EGF 和 20 纳克每毫升 bFGF，持续 8 天。每三天加入 200 微升 N2 培养基以维持大约 2 毫升的培养基。这是八天后神经球的图像。

在此过程中，收集神经球，并将它们转移到新的 15 毫米锥形管中。将试管以 145 倍 g 离心五分钟。随后，弃去上清液，并用0.5毫升解离缓冲液重悬神经球。将它们与 0.5 毫升解离缓冲液在 37 摄氏度的水浴中孵育 5 分钟，以将神经球解离成单个细胞。

轻轻地上下移液样品溶液少于五次，然后以 145 倍 g 离心管 5 分钟。随后，弃去上清液，并用一毫升N2培养基重悬神经球。用PLL层粘连蛋白包被六孔板后，用每孔两毫升N2培养基将细胞接种为每毫升2.5 x 10⁵个细胞。在传代前，通过每天处理生长因子来维持SCZ成体神经干细胞五天。