选择性去除大鼠小脑颗粒神经元培养物中的小胶质细胞

取收获的大鼠小脑并将其切成碎片。

将片段转移至含有胰蛋白酶的离心管中并进行孵育。

胰蛋白酶消化组织的细胞外基质，使小脑颗粒神经元以及小胶质细胞和星形胶质细胞等非神经元细胞松散开来。

加入含有胰蛋白酶抑制剂和DNase的缓冲液。该抑制剂可使胰蛋白酶失活，而DNase则降解污染的DNA。

离心并弃去上清液。

将组织重悬于含有抑制剂和DNase的缓冲液中，并通过机械法解离，形成单细胞悬液。

将悬液覆盖到含有蛋白质的缓冲溶液上。

离心并弃去含有细胞碎片的上清液。

将细胞重悬于培养基中，并接种到多聚-L-赖氨酸包被的盖玻片上，以促进细胞贴附。

移除培养基。用新鲜培养基洗涤细胞，然后加入含有细胞周期抑制剂的培养基，以抑制胶质细胞增殖。

用含有溶酶体抑制剂的新鲜培养基替换一半的培养基。

该抑制剂选择性地靶向小胶质细胞并破坏溶酶体膜，导致小胶质细胞死亡并从培养物中清除。

首先，取4至7日龄的大鼠幼崽小脑组织。立即将其放入含有5毫升溶液A的培养皿中，并置于冰上。随后，吸去小脑组织上多余的溶液，将组织置于培养皿盖内。接着，用灼烧过的剃刀刀片至少沿三个不同方向将组织充分切碎。

随后，将切碎的组织加入溶液B中。置于37摄氏度水浴中孵育5分钟，每隔几分钟轻轻振荡一次。然后，向管中加入20毫升溶液D以中和胰蛋白酶。振荡混匀后，在65 g 条件下离心5分钟。之后，弃去上清液，将沉淀重悬于4毫升溶液C中。

使用三支直径依次减小的火焰抛光玻璃移液管，每支各抽吸吹打样本10次，直至悬液尽可能均匀。接着，缓慢而轻柔地将少量该匀浆液滴加到BSA-EBSS液面上方。若匀浆开始沉入BSA-EBSS中，则需进一步吹打并添加少量溶液C。匀浆应形成一层停留在BSA-EBSS液面之上。

以 100 g 离心 5 分钟，不要振荡。然后，弃去上清液，并将沉淀重悬于 1 毫升 MEM 培养基中。使用血细胞计数板对细胞进行计数，并以每盖玻片 800,000 个细胞的密度，将细胞接种于 500 微升 MEM 培养基中。随后，将细胞置于 37 摄氏度、含 6% 二氧化碳的培养箱中孵育。接着，配制含有 10 微摩尔细胞周期抑制剂 AraC 的 MEM 培养基溶液。

对于每个盖玻片，将250微升旧培养基保留在新的24孔板中，其余部分吸除。加入250微升正常MEM培养基洗涤细胞。随后，将250微升保留的旧培养基重新加回细胞中，并补充250微升含AraC的培养基。

在此步骤中，向5毫升MEM培养基中加入纯LME，使LME的终浓度为150毫摩尔。使用酸碱溶液将溶液调至pH 7.4。然后，用28毫米聚醚砜（PES）0.2微米注射器滤器进行无菌过滤。

接下来，将LME溶液用MEM培养基稀释至50毫摩尔浓度。然后，将其与用于对照组的正常MEM培养基一同置于37摄氏度的水浴中孵育10分钟。10分钟后，从每孔CGC培养物中移除250微升MEM培养基。随后，将培养基继续保留在37摄氏度环境中。

接下来，用含有两倍LME的MEM培养基处理细胞，对照组细胞则使用不含LME的预热MEM培养基。将细胞置于37°C、含6%二氧化碳的湿润环境中孵育1小时。随后，用新鲜的预热MEM培养基洗涤细胞两次，以去除含LME的培养基。

然后，将保留的培养基更换为等量的新鲜预热 MEM 培养基。最后，将培养物置于37摄氏度、6%加湿二氧化碳环境中孵育。