从大鼠小脑颗粒神经元培养物中选择性去除小胶质细胞

取收获的大鼠小脑，将其切成碎片。

片段转移到含有胰蛋白酶的试管中并孵育。

胰蛋白酶消化组织的细胞外基质，松弛小脑颗粒神经元，以及小胶质细胞和星形胶质细胞等非神经元细胞。

加入含有胰蛋白酶抑制剂和DNase的缓冲液。抑制剂使胰蛋白酶失活，而 DNase 降解污染的 DNA。

心并丢弃上清液。

组织重悬于含有抑制剂和DNase的缓冲液中，并机械解离以形成单细胞悬浮液。

悬浮液覆盖在含蛋白质的缓冲溶液上。

心并丢弃含有细胞碎片的上清液。

将细胞重悬于培养基中，并将它们接种在聚-L-赖氨酸包被的盖玻片上，以促进细胞附着。

取出介质。用新鲜培养基洗涤细胞，然后加入含有细胞周期抑制剂的培养基，以防止神经胶质细胞增殖。

含有溶酶体抑制剂的新鲜培养基替换一半的培养基。

该抑制剂选择性地靶向小胶质细胞并破坏溶酶体膜，导致小胶质细胞死亡并从培养物中去除。

收集 4 到 7 天大的幼鼠的小脑开始此过程。立即将它们放入装有五毫升冰溶液A的培养皿中。然后，从小脑中取出多余的溶液，并将组织放入培养皿盖中。接下来，用燃烧良好的剃须刀片在至少三个不同的方向上将纸巾切碎。

随后，将切碎的组织加入溶液 B 中，将其放入 37 摄氏度的水浴中五分钟，每隔几分钟轻轻摇晃一次。然后，向试管中加入 20 毫升溶液 D 以中和胰蛋白酶。摇匀并以 65 g 离心五分钟。然后，倒掉上清液。将其重悬于四毫升溶液C中。

用三个直径减小的火焰玻璃移液器中的每一个研磨样品10次，直到悬浮液尽可能均匀。接下来，缓慢而轻轻地在BSA-EBSS上滴几滴这种匀浆。如果它开始通过 BSA-EBSS 下沉，请进行更多研磨并添加更多溶液 C。匀浆应位于 BSA-EBSS 顶部的一层中。

100 克旋转五分钟，不要摇晃。然后，除去上清液并将沉淀重悬于一毫升MEM培养基中。使用血细胞计数器计数细胞，并在 500 微升 MEM 培养基中接种每个盖玻片 800,000 个细胞。之后，将它们放入 37 摄氏度的培养箱中，含有 6% 的二氧化碳。然后，制备含有10微摩尔细胞周期抑制剂AraC的MEM培养基溶液。

对于每个盖玻片，在新鲜的 24 孔板中保留 250 微升旧培养基，并吸出其余的。加入 250 微升普通 MEM 培养基洗涤细胞。随后，将 250 微升旧培养基加回细胞中，并加满 250 微升含 AraC 培养基。

在此过程中，将纯LME添加到5毫升MEM培养基中，以获得150毫摩尔LME的最终浓度。使用酸碱溶液将溶液恢复至pH 7.4。然后，使用带有 0.2 微米注射器过滤器的 28 毫米 PES 对其进行无菌过滤。

接下来，在MEM培养基中将LME溶液稀释至50毫摩尔的浓度。然后，将其与用于对照培养的普通MEM培养基一起放入37摄氏度的水浴中10分钟。10分钟后，从每个CGC培养物中取出250微升MEM培养基。然后，将介质保持在 37 摄氏度。

接下来，用含有两倍LME的MEM培养基或不含LME的预热MEM培养基处理细胞进行对照培养。将细胞在37摄氏度的加湿气氛中与6%二氧化碳孵育一小时。然后，在新鲜的预热MEM培养基中洗涤细胞两次，以除去含LME的培养基。

然后，用等量的新鲜预热MEM培养基替换保留的培养基。最后，将培养物在37摄氏度的6%加湿二氧化碳中孵育。