使用荧光激活细胞分选分离小鼠视网膜神经节细胞

小鼠视网膜放在湿润的细胞过滤器上，并以圆周运动浸渍，以将视网膜细胞与细胞外基质分离。

将过滤器转移到收集管中。

过滤器中加入磷酸盐缓冲液和血清溶液以洗涤和收集细胞。

心以沉淀细胞。弃去上清液并将细胞重悬于磷酸盐缓冲液和血清溶液中。

添加与细胞上的Fc受体结合的阻断抗体，防止靶抗体的非特异性结合。

接下来，添加荧光标记和未标记的一抗，这些一抗与各种细胞类型上的特定细胞表面标记物结合。

洗涤以去除未结合的抗体。

添加荧光标记的二抗以与未标记的一抗结合。

洗涤以去除未结合的抗体。

进行荧光激活细胞分选或FACS，以捕获标记细胞的不同荧光信号，并从各种视网膜细胞群中分选视网膜神经节细胞。

将多达 12 个视网膜放在用 PBS 和 FBS 润湿的无菌 70 微米尼龙过滤器上，并用 10 毫升注射器柱塞的后端以打圈的方式轻轻浸渍视网膜。当所有细胞都解离后，将过滤器放在聚丙烯收集管上，并使用 P1000 移液器将细胞通过过滤器过滤到收集管中。

用PBS和FBS冲洗过滤器，将洗涤液汇集在收集管中。加入足够的PBS和FBS，使最终体积达到每个视网膜1毫升溶液，并通过离心收集细胞。然后，将沉淀重悬于 PBS 加 FBS 中，每 5 个视网膜浓度为每 1 毫升培养基。接下来，在室温下，每 1 x 10⁶ 细胞用 1 微升抗小鼠 CD16/32 抗体阻断每个管中的任何非特异性 FC 受体结合 10 分钟。

封闭孵育结束时，将感兴趣的抗体混合物加入细胞中，轻轻移液，在避光的冰上孵育30分钟。然后，在4毫升的PBS和FBS最终体积中洗涤细胞两次。用适当的二抗在避光的冰上再标记细胞 30 分钟，然后在 PBS 和 FBS 中洗涤 2 次，并将样品管加载到流式细胞仪上。