原代胚胎小鼠中脑多巴胺神经元的分离和培养

取从小鼠胚胎中脑腹侧区域分离的中脑底组织。

该组织富含发育中的多巴胺神经元，这些神经元会释放神经递质多巴胺。

添加酶溶液以分解组织基质，从而松动细胞。

加入含有DNase I的血清溶液，机械解离消化的组织以生成细胞悬液。血清蛋白抑制酶，而DNase I降解细胞裂解过程中释放的细胞外DNA，防止细胞结块。

让组织碎片沉降并将悬浮的细胞转移到新鲜的试管中。

心并除去上清液，然后将细胞重悬于多巴胺神经元培养基或DPM中。

取一个在孔中心涂有细胞培养底物的微孔板，形成微岛。

细胞转移到微岛的中间，以高密度培养它们。

孵育，让细胞粘附在微岛上。

DPM填充孔并孵育，促进多巴胺神经元的生长。

为了从小鼠胚胎第 13.5 天的小鼠胚胎中建立原代胚胎中脑培养物，将所有收获的中脑底汇集到同一个 1.5 毫升管中，并洗涤样品 3 次，每次洗涤 500 微升不含钙和镁的 HBSS。最后一次洗涤后，用0.5%胰蛋白酶代替HBSS，在37摄氏度下孵育30分钟。

孵育结束时，将 500 微升新鲜制备的 DNase I 在 FBS 溶液中加入部分消化的组织中，并使用带有火抛光尖端的硅化玻璃移液器研磨组织。当只能观察到微小的、几乎看不见的颗粒时，让这些组织碎片沉降到微量离心管的底部，并将上清液转移到空的 15 毫升锥形聚丙烯管中。

一毫升HBSS加入FBS中含有DNase I的管中，并通过移液混合数次。将一毫升该溶液转移到剩余的组织颗粒中，并再次研磨样品。然后，将消化的细胞悬液与上清液管混合在一起，而不转移任何剩余的组织碎片。在HBS中用FBS中剩余的DNase I再次研磨组织样品后，通过离心沉淀收集的细胞，并在不干扰沉淀的情况下吸出上清液。

每次洗涤在两毫升温热的多巴胺神经元培养基中洗涤细胞两次，并在微量离心管中以每6微升新鲜、温热的培养基浓度3 x 10⁴个细胞重悬细胞。接下来，从每个预先制备的微岛中取出培养基，并通过轻柔的移液混合细胞，然后使用 10 微升移液器向每个微岛添加 6 微升细胞。

所有细胞后，用 150 微升水或 PBS 填充板边缘的空孔，并将板放入细胞培养箱中一小时。在孵育结束时，向每个孔中加入100微升新鲜多巴胺神经元培养基，并将板放回培养箱。