原代小鼠中脑多巴胺能神经元的分离与培养

取自小鼠胚胎中脑腹侧区域分离的中脑底部组织。

该组织富含正在发育的多巴胺能神经元，这些神经元可释放神经递质多巴胺。

加入酶溶液以降解组织基质，从而松散细胞。

加入含有DNase I的血清溶液，并通过机械法解离消化后的组织，以制备单细胞悬液。血清蛋白可抑制酶活性，而DNase I可降解细胞裂解过程中释放的胞外DNA，防止细胞聚集成团。

让组织碎片沉降，并将悬浮的细胞转移至新的离心管中。

离心并去除上清液，然后将细胞重悬于多巴胺能神经元培养基（DPM）中。

取一块在孔中央包被有细胞培养基质的微孔板，形成微小的细胞岛。

将细胞转移至微岛的中央，以高密度进行培养。

孵育，使细胞贴附于微岛结构上。

用 DPM 填充孔板并进行孵育，以促进多巴胺能神经元的生长。

为了从小鼠胚胎第13.5天的胚胎中建立原代中脑培养物，将所有收集到的中脑腹侧组织放入同一个1.5毫升离心管中，每次用500微升不含钙和镁的HBSS洗涤样本，共洗涤三次。最后一次洗涤后，弃去HBSS，加入0.5%胰蛋白酶，在37摄氏度下孵育30分钟。

孵育结束后，向部分消化的组织中加入500 µL新鲜配制的含FBS的DNase I溶液，使用经硅烷化处理且尖端经火焰抛光的玻璃移液管对组织进行吹打。当仅能观察到微小且几乎不可见的颗粒时，让这些组织碎片沉降至微量离心管底部，然后将上清液转移至一个新的15 mL圆锥形聚丙烯管中。

向含有FBS中DNase I的离心管中加入1毫升HBSS，通过移液反复混匀数次。取1毫升该溶液加入剩余的组织颗粒中，再次吹打混匀样品。然后，将消化后的细胞悬液与上清液离心管合并，注意不要转移任何残留的组织碎片。用HBS中剩余的含FBS的DNase I对组织样品再进行一次吹打处理后，通过离心沉降收集的细胞，并小心吸走上清液，避免扰动沉淀物。

用两毫升预热的多巴胺能神经元培养基洗涤细胞两次，每次洗涤后将细胞重悬于6微升新鲜温热培养基中，细胞浓度为每6微升含3 × 10⁴个细胞，置于微量离心管中。接着，移除每个预先制备的微岛中的培养基，轻轻吹打混匀细胞，然后使用10微升移液器将6微升细胞悬液加入每个微岛中。

当所有细胞均添加完毕后，在培养板边缘的空孔中加入 150 µL 水或 PBS，并将培养板放入细胞培养箱中孵育 1 小时。孵育结束后，向每孔中加入 100 µL 新鲜的多巴胺能神经元培养基，然后将培养板重新放回培养箱中。