通过活细胞荧光成像检测培养神经元中的过氧化氢水平

取培养在包被的盖玻片上的斑马鱼视网膜神经节细胞。

这些细胞表达一种基因编码的生物传感器，该传感器产生对氧化还原敏感的绿色荧光蛋白 roGFP2，并将其与对过氧化氢敏感的酶 Orp1 融合。 

将带有培养基的盖玻片转移至活细胞成像培养皿中，并将培养皿置于倒置显微镜上。

更换为无血清培养基以降低背景荧光。

由于过氧化氢水平较低，roGFP2 保持在其还原构象。

依次在 405 和 480 nm 波长下激发生物传感器。

还原型 roGFP2 在 480 nm 处具有激发峰。

更换为含有过氧化氢的培养基。

过氧化氢进入细胞并与 Orp1 反应，使 roGFP2 氧化。

再次激发该生物传感器。

氧化的 roGFP2 在 405 nm 处荧光增强，在 480 nm 处荧光减弱。

计算荧光强度比值。

该比值的升高表明细胞内过氧化氢水平升高。

成像当天，在显微镜下检查细胞，以确认RGC轴突的生长情况。进行活细胞成像时，将盖玻片从培养皿转移至活细胞成像腔室。使用配备微分干涉差（DIC）物镜、OG590长通红色滤光片和EM-CCD相机的倒置显微镜。

成像前，将 ZFCM+ 培养基更换为 ZFCM-。使用 10 倍物镜定位细胞后，采用油浸 60 倍物镜并附加 1.5 倍放大倍率进行图像采集。

首先，获取 DIC 图像，然后使用适当的滤光片组对 roGFP2-Orp1 进行成像。完成第一组图像采集后，更换含有不同处理溶液的培养基。为避免 pH 值和渗透压变化，应每隔 30 分钟成像时更换一次培养基。