建立用于脑片双光子钙成像的全细胞记录构型

取一支刺激移液管，其中含有溶解于人工脑脊液（ACSF）中的红色钙不敏感荧光染料。

将移液管置于海马脑片中目标神经元附近。

将一根内含记录电极的膜片钳电极尖端（浸在含有红色钙不敏感和绿色钙指示荧光染料的电解质中）置于目标位置附近。

施加恒定的正压以短暂扰动组织表面，提示已接近目标区域。

当神经元膜上形成凹陷时，释放压力以形成封接。

施加负压以加强密封。

将膜电位稳定在恒定的负电压。

继续施加负压以破裂膜，使含有荧光染料的电解质在神经元内扩散。

观察目标树突棘的红色荧光，并将刺激电极靠近其位置。

施加电脉冲以打开钙离子通道。

使用双光子显微镜观察由绿色荧光指示的钙离子水平的瞬时变化。

在此步骤中，将海马脑片转移至激光扫描双光子显微镜物镜下的浴槽中，并持续用含氧的正常人工脑脊液（ACSF）灌流浴槽。随后，利用红外差分干涉相衬显微镜，根据细胞的大小、形状和位置定位目标细胞。

随后，用含有红色荧光染料的正常 ACSF 溶液填充刺激电极。将其置于脑片上方，使电极尖端位于目标细胞所在的同一区域。接着，用膜片钳溶液填充记录电极，并将其连接至放大器的前端。将其置于脑片上方，使电极尖端正对目标细胞的上方。

随后，将注射器安装到三通旋塞阀上，并通过塑料管将其连接至记录电极。向记录电极内注入持续的正压，并保持旋塞阀处于关闭位置。降低记录电极，使其尖端正对目标细胞上方。当电极与细胞膜接触后，通过将旋塞阀转至开放位置以释放压力。

然后，使用连接在旋塞上的空注射器对膜片钳电极施加轻微的负压，直至电极电阻达到1吉欧姆。在数据采集软件的膜片测试窗口中，将细胞钳制在负60毫伏。持续施加负压，直至电极电阻下降，形成全细胞记录模式。

为了记录电刺激诱导的树突钙瞬变，使用红色荧光信号定位感兴趣的树突。将刺激电极置于脑片表面，位于目标树突上方。缓慢将刺激电极下降至距离树突10到15微米处，尽量减少移动，以避免干扰全细胞记录构型。