一种非侵入性研究斑马鱼胚胎运动神经元电生理学的方法

将基因工程改造的斑马鱼胚胎置于体视显微镜下，观察由脊髓运动神经元引发的自发性尾部收缩现象。

这些神经元的固有特性导致钠离子通道介导的离子内流，从而引发自发性膜去极化，并产生动作电位，动作电位传播至肌肉，触发尾部卷曲。测量卷曲频率。

将一些胚胎转移至钠通道阻断剂中，以抑制钠离子内流，并评估其卷曲频率的降低情况。

将未经处理的胚胎置于融化的琼脂糖中；待琼脂糖凝固以限制其运动，然后在荧光显微镜下观察。

运动神经元表达一种生物传感器，该传感器具有与供体和受体荧光团融合的膜结合型电压感应结构域（VSD）。

去极化改变电压感应结构域的构象，使荧光基团相互靠近。

激发后，供体将能量转移给受体，导致受体产生荧光发射。

加入阻断剂以抑制去极化，从而降低受体发射信号，证实阻断剂介导了对神经元自发去极化的抑制作用。

进行自发性尾部卷曲分析时，将胚胎转移至含有0.2% DMSO的鱼水中的一件90毫米圆形培养皿中，并使用两把尖头珠宝镊子或细针手动去除胚胎的绒毛膜。随后，在28摄氏度条件下孵育胚胎5分钟。通过安装在体视显微镜上的数码相机，在室温下进行一分钟的视频录制，以检测尾部卷曲现象。

接下来，以每秒30帧的时间分辨率采集时间序列。然后，通过计算单位时间内弯曲次数来确定自发性尾部卷曲的频率。为评估药物利鲁唑的作用，将胚胎转移至一个新的盛有含5 µM利鲁唑鱼水的90毫米培养皿中。随后，在28°C下孵育胚胎5分钟，然后录制一段时长为一分钟的视频并进行行为学分析。

现在，将20至24小时受精龄的胚胎置于含有鱼水的35毫米玻璃底成像培养皿中，用1%低熔点琼脂糖在37摄氏度下进行包埋。将胚胎侧向摆放，并在室温下等待琼脂糖凝固。

接下来，将成像培养皿转移至共聚焦显微镜的载物台上。通过488纳米氩激光激发单体Umikinoko-Green，识别表达生物传感器的运动神经元。然后，将其发射波长设定在495至525纳米之间，并点击记录。

进行FRET测量时，使用488纳米激光激发FRET对中的供体mUKG。同时，利用两个光电倍增管，分别检测供体发射的荧光和单体Kusabira-Orange受体发射的荧光。在实验开始时，优化用于记录mUKG荧光的光电倍增管1的增益和偏移，并在整个实验过程中保持其不变。

为设置偏移量，使用Q-查找表将图像颜色更改为强度值。在激光关闭的情况下扫描时，调节偏移量滑块，使背景像素的强度略高于零。使用相同的查找表，打开激光。扫描过程中，调节增益滑块以最大化信噪比，同时注意避免像素饱和。

在软件采集窗口中，从下拉菜单中选择 xyt 采集模式和 512×64 像素的图像视场大小。然后，设置对胚胎脊髓神经元电压变化的记录，以每 30 毫秒采集一个 xy 平面，持续一分钟。评估给予利鲁唑后对同一神经元膜去极化的影响，在加入含 5 微摩尔利鲁唑的鱼水后五分钟，采集一组新的数据。