小鼠嗅觉感觉神经元的穿孔膜片钳记录

取一只基因工程小鼠的断头。其鼻腔内的嗅觉上皮含有表达荧光蛋白标记的嗅觉受体的嗅觉感觉神经元（OSNs）。

去除皮肤并解剖头部，分离带有附着嗅上皮的鼻中隔。

将上皮组织分离并固定在记录室中。

使用荧光显微镜检测标记的受体，以定位嗅觉神经元的树突 knob。

使用含有制霉菌素（一种膜穿孔抗生素）的细胞内溶液准备记录电极。

施加正压以防止移液管堵塞。将移液管插入上皮层并接近一个嗅觉感觉神经元（OSN）。

切换至负压，使细胞膜形成封接。施加电流以维持膜电位在静息电位水平。

制霉菌素可穿透细胞膜，从而实现对细胞内离子电流的测量。

将含有气味刺激物的移液器置于嗅觉感觉神经元（OSN）附近。释放刺激物，使其与气味受体结合，触发离子通道开放，导致离子内流。记录由此产生的电生理信号。

本实验方案需准备 2 至 4 周龄的小鼠。在本演示中，使用表达 OR/IRES/tauGFP 的小鼠。

通过使用OR/IRES/tauGFP小鼠，所有表达目标嗅觉受体（OR）的神经元都将被GFP标记。该方法可用于在所有区域表达的嗅觉受体。然而，对于在背侧区域表达的嗅觉受体，解剖和记录操作将更为简便。

首先麻醉一只小鼠，然后将其处死并断头。

该实验方案的结果取决于解剖的质量。这些解剖步骤必须尽可能短暂且精确。

开始手术时，使用解剖剪沿背部中线做一纵向切口。将皮肤拉开并去除。然后沿下颌做切口，并平行于牙齿做一冠状切口。由此去除上切牙。接着，在眼睛后方沿头部做一圈冠状切口。弃去头部后段，将前段转移至冰冻的任氏液中。

现在，在解剖显微镜下于5至10分钟内分离隔膜。首先沿腹侧进行纵向切开，然后沿鼻腔背外侧的背侧骨进行纵向切割。

接下来，去除大部分骨骼和腭部结构。将分离出的鼻中隔及其附着的上皮组织转移至含有充氧林格液的容器中，室温保存。在五分钟内完成记录前的最后准备工作。

溶液温度不可过高，否则制备的样本会显得受损。为记录神经上皮，首先用镊子将上皮从其下方的隔膜上剥离。然后，使用显微Vannas剪刀剪开隔膜的前端，以释放上皮组织。

现在，小心地取出犁鼻器。从其背侧附着处将其切断。将分离的上皮组织转移至记录室，黏膜面朝上。放置妥当后，使用压簧将组织压平。然后，将记录室转移至直立显微镜下。在持续用室温新鲜任氏液灌流的同时，使用40倍水浸物镜观察神经上皮。

首先，寻找目标细胞，在本例中即表达EGFP的细胞。因此，使用480纳米的光来扫描在530至550纳米范围内发射荧光的细胞。在明场下以80至160倍放大倍数观察时，目标树突小结和嗅觉神经元应能与支持细胞明显区分。

现在，用制霉菌素溶液填充电极。轻弹电极以排出形成的气泡，并将电极安装到电极 holder 上。接着施加一定的正压，预期电阻应在 15 至 20 兆欧之间。然后，在保持正压的同时，将电极移向细胞。

当电阻增加至约40兆欧时，释放压力并施加轻微的负压。如果