利用全细胞膜片钳技术测定生长激素对吻肽神经元的作用效果

将转基因小鼠下丘脑切片固定在灌流 aCSF 的记录室中。

该脑片含有表达荧光融合蛋白的吻素神经元，这类神经元对生殖系统的调控至关重要。

组装一个包含记录电极和内液的微量移液管。

在显微镜下定位荧光kisspeptin神经元。

对移液管施加正压，并将其推进至目标神经元。接触后，压力会在神经元膜上形成一个凹陷。

施加短暂的负压，使微电极与细胞膜之间形成高阻封接。

将钳制电压设置为神经元的生理静息电位，以获得准确的测量结果。

施加短暂的负压脉冲以破膜，形成全细胞记录构型。

通过监测各项参数来确认神经元的活性。

引入一种测试用生长激素，激活信号通路并诱导神经元膜电位的变化。

通过测量膜电位的变化来确定生长激素对神经元活动的抑制作用。

使用丙烯酸转移移液管，一次将一个感兴趣的脑片转移至记录室。用脑片固定器固定脑片，以防止其在aCSF灌流过程中移动。使用浸入式显微镜的低倍物镜（10×或20×）将脑片置于记录室中央位置。

切片位置的选择至关重要，以确保在显微镜下能够清晰观察目标区域，并使记录用微电极能够准确到达。在定位到目标区域后，切换物镜至63倍高倍镜，聚焦于组织层面，观察目标区域内内源性荧光蛋白及细胞形态，从而确定脑片表面的神经激肽B细胞。

当找到一个可能的目标细胞时，使用鼠标光标或在感兴趣区域上绘制方框等标记方式，在计算机屏幕上标出该细胞。屏幕上所做的标记有助于引导记录用微电极至目标细胞的位置。确定目标细胞的精确位置后，抬起物镜，将装有内液的记录微电极插入电极夹持器中，并确保内液与银电极接触。

使用连接至微电极夹持器的1至3毫升空气填充注射器，通过聚乙烯管在将微移液管浸入aCSF溶液之前施加正压，以防止碎屑进入微移液管。利用显微操作器，将微移液管引导至物镜中心下方。调节显微操作器的按钮，控制微移液管在x、y、z轴方向上的移动，使其对准目标细胞。

调整焦距以观察微移液管的尖端，并将焦平面逐渐靠近，但不要过于接近脑片。降低显微操作仪的速度，缓慢将微移液管降至焦平面上，确保微移液管尖端不会突然刺入脑片，而是缓慢下降直至接触细胞表面或目标区域。

使用装有1至3毫升空气的注射器施加轻微的正压，以清除进路中的任何碎屑，然后缓慢移动显微操作器的x、y、z轴，使微电极尖端靠近并接触目标细胞，由此产生的压力会形成一个凹陷。在形成凹陷后，借助软件中的电压钳模式，通过连接微电极夹持器的管道用嘴施加短暂的微弱负压，持续1至2秒，以在微电极与细胞之间形成封接。

如果封接在约一分钟内保持机械稳定且无噪声干扰，则将钳制电压设置为所研究细胞最接近的生理静息电位。对于下丘脑的吻素神经元，建议设置为负50毫伏。接下来，通过口腔施加短暂的吸力，使微电极尖端与细胞形成封接处的细胞膜破裂，从而避免破裂的膜堵塞微电极，或吸附较大片的膜结构，或整个细胞。

通过施加足够的吸力，可实现良好的全细胞构型。请查阅所用系统的设置手册。在细胞膜破裂后，启用电压钳模式下的全细胞选项，并点击与全细胞标签相对应的自动命令。

接下来，按照文本稿件中的描述，在软件中检查细胞活力参数。在实验过程中监测串联电阻和细胞的稳态电容。一旦形成稳定的全细胞记录模式，即在电压钳模式下测量突触电流。在电流钳模式下记录静息膜电位的变化以及诱导产生的静息膜电位波动。