Plasmodium falciparum 寄生虫与人脑微血管内皮细胞黏附的筛选方法

本实验的总体目标是筛选能够与人脑微血管内皮细胞结合的疟原虫（plasmodium）、fpar 及寄生虫。首先将含有感染与未感染红细胞混合物的疟原虫（plasmodium）、fpar 和寄生虫培养物与一层人脑微血管内皮细胞共同孵育；随后通过多次用培养基洗涤，去除未感染及未结合的红细胞；最后加入新鲜红细胞，以支持寄生虫群体的进一步生长。

几周后的最后一步是，一旦达到足够的寄生虫数量，立即重复整体筛选过程。最终，通过显微镜观察显示大量寄生虫结合于HBE五i。该方法有助于解答脑型疟疾领域的关键问题，例如参与细胞滞留过程的寄生虫配体或宿主受体分子的鉴定。

通过白细胞去除滤器过滤，将O型阳性全血中的红细胞与白细胞分离，从而制备人红细胞。以1000 G离心10分钟，弃去上清液，并用不含PMI的不完全培养基重悬沉淀。

再重复此洗涤步骤一次，然后重新悬浮沉淀。在我们的PMI不完全培养基中，红细胞以50%的红细胞压积在4°C条件下可保存一周。培养感染了Odium Valspar的红细胞。

使用含2%红细胞比容的完全RPMI培养基，在37摄氏度、3%二氧化碳、1%氧气和96%氮气条件下每天培养。制备厚血涂片以评估寄生虫的发育阶段。每天通过以500 ×g离心五分钟更换培养基。

每周约一次吸除上清液，并加入新鲜的完全RPMI培养基。通过5%山梨醇水溶液处理使寄生虫同步化。在观察到至少5%至10%环状体阶段培养物的次日，可进行筛选实验。

此外，每60毫米的HBE5i细胞培养皿需要准备足量的寄生虫培养物，以获得30微升的P细胞体积。通过向培养皿中加入每平方厘米2微克的纤维连接蛋白及无菌生理盐水，准备60毫米组织培养皿，用于接种人脑微血管内皮细胞系（HBE5i）。

将培养皿在37摄氏度下孵育5至20分钟，然后吸除纤连蛋白溶液。接着通过离子化和离心法从25平方厘米的组织培养瓶中收获HBE五I细胞，将细胞沉淀重悬于10毫升DMEM完全培养基中。然后取1.5毫升该细胞悬液加入经纤连蛋白处理的组织培养皿中，在37摄氏度及5%二氧化碳条件下孵育2至3天，直至培养物达到50%至100%汇合度，此时寄生虫培养物即可用于检测当天的细胞侵袭实验。

人支气管上皮（HBE）五代培养细胞应处于50%至100%的融合状态。同时，寄生虫培养物应处于色素滋养体阶段，寄生率至少为5%至10%，红细胞压积为2%。首先，用移液器从培养瓶中吸取1.5毫升寄生虫培养物，转移至15毫升离心管中。

在 500 ×g 条件下离心培养物 5 分钟，然后在 10 毫升新配制的温热 DMEM 不完全培养基中重悬。最后一次离心完成后，重复此洗涤步骤一次。

将 DMEM 不完全培养基重悬，取 30 微升沉淀物溶于 1.5 毫升 DMEM 不完全培养基中，该培养基添加有 1% BSA。接下来，取出直径为 60 毫米的 hvac.Five 培养皿。

眼细胞吸取培养基，并用三毫升 DMEM 不完全培养基洗涤两次。加入寄生虫溶液，放入 HPE 五眼细胞培养皿，在组织培养孵育箱中总共孵育 75 分钟。

孵育过程中，分别在两个时间点轻轻摇动并旋转培养皿，使寄生虫重新悬浮。使用塑料移液管吸去培养基，加入3毫升预热的不含血清的DMEM培养基，重复洗涤5次；最后一次洗涤后，轻轻摇动培养皿，然后在倒置显微镜下观察培养皿。若仍可见大量未感染的红细胞，请重复上述洗涤步骤以去除这些细胞。

从培养皿中吸除培养基后，将40微升压积体积的新鲜红细胞重悬于预热的RPMI完全培养基中，并将细胞悬液加入培养皿。将培养皿放入气相培养室，随后用3%二氧化碳、1%氧气和96%氮气混合气体孵育3分钟。

将培养皿置于37摄氏度的培养箱中过夜。在此培养期间，裂殖阶段的寄生虫会破裂并重新侵入红细胞。第二天，通过洗涤收获环状体阶段的寄生虫。

用RPMI不完全培养基以与之前类似的方式操作，但需更用力地吹打培养基并轻轻摇动培养板。保留使用过的全部培养基，其中将含有重悬的红细胞，并置于15毫升锥形管中。在倒置显微镜下检查培养板，确保所有红细胞均已从培养皿中去除，然后进行离心。

将含有洗涤后培养板中培养基的试管离心以沉淀寄生虫，弃去上清液，用五毫升 RPMI 完全培养基重悬，然后将混合物转移至 25 平方厘米的培养瓶中进行培养。寄生虫培养两到四周，直至获得足够的材料，即可进行新一轮筛选。

未经过筛选的HB三型疟原虫对hbe五型眼细胞的结合水平较低。本图像显示的是用2%戊二醛固定并经吉姆萨染色后在显微镜下以1000倍放大观察的hbe五型眼细胞，照片拍摄于未感染的红细胞及未结合的感染红细胞被洗去之后。每完成一轮筛选，越来越多的疟原虫能够与内皮细胞结合，且筛选可在更短的时间间隔内重复进行，经过五轮筛选后即可实现高效结合。

高结合力的寄生虫群体如本图所示，使用HB3 HBE寄生虫获得。本表格总结了成功筛选出的能够结合HEV-5的疟原虫alspar株系。需要注意的是，HB3株系还在TNF激活的HEV-5细胞上经过五轮筛选后获得。

与未筛选的DD2菌株相比，DD2双菌株对HBE5I的结合能力未见增加。这幅400倍放大图像显示了恶性疟原虫Alspar HB3寄生虫在筛选前与HD MEK皮肤内皮细胞的结合情况。此处显示的是恶性疟原虫Alspar HB3寄生虫经过四轮筛选后，与同一种皮肤内皮细胞系的结合情况。

该图显示了在筛选前，恶性疟原虫 HB3 裂殖子对 HPME 肺微血管内皮细胞的结合情况。经过四轮筛选后，恶性疟原虫 HB3 裂殖子对 HPME 细胞的结合能力增强。尽管 hde、C 和 HPMEC 的培养基略有不同，但筛选所用的方案与 hbe5 I 相同。通过该操作流程，可进一步采用 RT-PCR 或微量分析等方法，回答其他科学问题，例如对未筛选和筛选后寄生虫中变异表面抗原的转录特征进行表征。