联合记录小鼠毛囊机械刺激传入神经输出与神经末梢标记

从一只已解剖的小鼠耳廓（外耳）开始，暴露其相连的神经。

将拟用于记录的神经插入记录电极中。

去除耳廓边缘附近的脂肪层，以暴露毛囊基部，然后折叠皮肤以暴露毛发，便于刺激。

将机械刺激探针定位至接触并偏转毛发的位置。

这种刺激可激活感觉神经末梢，打开机械门控离子通道，允许正离子内流，并产生动作电位。

动作电位通过这些末梢传播至被记录的神经。观察该信号。

接下来，加入荧光染料并继续毛发刺激。

该染料可结合受刺激的神经元膜，并通过内吞作用被摄入，且不影响神经元活性。

刺激后，洗涤以去除未结合的染料。

加入淬灭剂以去除未内化的膜结合染料。

利用荧光显微镜观察毛囊中的染色情况，以鉴定受到机械刺激的神经末梢。

为了对刺激诱发的动作电位进行受控记录，使用一端为火焰抛光的10厘米硼硅酸盐微电极玻璃管、并连接至陶瓷压电驱动器的机械探针。将探针定位，使其运动方向与皮肤皱褶平行，并接触毛发而非皮肤表面，位置大约在皮肤上方0.5至1毫米处。随后，通过手动观察探针移动时是否有音频输出来确认刺激是否有效。

现在，设置软件以对一小片毛发区域施加机械刺激。例如，编程设置每10秒进行一次持续3秒、频率为5赫兹的正弦波刺激。这需要探针位移在200至2000微米之间。随后，采用重复的自动刺激来检查神经记录反应的一致性。应能够获得可重复的结果。

当结果稳定后，将重复频率降低至每30秒一次。进一步的操作说明详见文本方案。为研究机械感受通道的特性并标记毛囊周围的机械感受末梢，可在溶液中加入10 µM FM143，并持续孵育60分钟，同时继续使用振荡探针刺激毛发。

该染料可阻断培养的感觉神经元及耳蜗毛细胞中候选的换能通道。然而，它并不能阻断成熟毛囊传入神经末梢在原位的放电活动。in situ的末梢标记显示，该染料作用于神经末梢终端，这些终端在染料暴露期间仍持续对机械刺激产生反应。