小鼠海马脑片中微小RNA介导的兴奋性突触后电流抑制

取含有感染了重组病毒载体的CA3神经元的小鼠海马脑片。

病毒基因组表达一种带有荧光报告蛋白的光敏通道，以及一种可下调电压门控钙通道表达的微小RNA。

在避光条件下，将脑片置于记录室中。使用显微镜识别荧光标记的CA3神经元。

将记录电极贴附到接受感染的CA3神经元输入的CA1神经元上。破裂细胞膜以记录细胞内离子电流。

加入抑制剂以阻断抑制性神经递质受体，从而仅允许兴奋性信号传递。

利用光脉冲刺激感染的CA3神经元中光敏通道，产生动作电位。

在未感染的小鼠中，动作电位激活电压门控钙通道，引起钙离子内流，从而触发神经递质释放。这些神经递质在CA1神经元中引发兴奋性突触后电流（EPSCs）。

在感染的小鼠中，microRNA 介导的电压门控钙通道减少导致兴奋性突触后电流（EPSC）受到抑制。

对于本实验方案，使用在15天或更长时间前已根据Cetin及其同事先前发表的方案向脑内注射了rAAV1/2的动物。分离脑组织，并使用振动切片机在充氧的冰冻aCSF中制备急性脑切片。

收集目标区域的脑片，并尽量减少其暴露于光照下，以避免激活光遗传探针。将脑片置于相同的aCSF中，在37摄氏度下孵育30分钟使其恢复。使用专为脑片孵育设计的孵育 chamber。随后，将脑片转移至室温环境，在此条件下可保持健康状态6至8小时。

接下来，将脑片转移至记录室，并以每分钟2 mL的速度持续灌注aCSF。随后，快速检查表达的荧光报告基因信号，以确定感染的定位与强度。然后，用细胞内液填充膜片电极。

现在，在红外光照下，对接受感染神经元突触输入的神经元建立紧密封接的全细胞记录构型。串联电阻可以不进行补偿，但应保持恒定且较低。例如，如果感染的是CA3锥体神经元，则对CA1区域近端至中段通路的锥体神经元进行膜片钳记录。

当细胞开始出现皱缩或肿胀，膜片钳记录变得困难，或记录的膜片不稳定时，所选的脑片已不够健康，无法进行有效记录。

接下来，使用药理学方法分离待研究的突触电流。例如，若旨在研究兴奋性突触传递，可通过向灌流液中添加荷包牡丹碱（bicuculline）来阻断抑制性突触传递。

然后，使用与光学纤维耦合的473纳米蓝光激光器照射感染神经元的胞体，以诱发突触电流，例如兴奋性突触后电流。切勿将激光直接照射到神经元的轴突上。

例如，避免将光线照射到Schaffer侧支上。直接去极化轴突是不可取的。然后，将刺激时长调整至最短，以减少每次光脉冲诱发多个动作电位的可能性。

接下来，调整激光强度，以诱发微小但可明确检测到的突触电流。例如，在CA3与CA1锥体神经元之间的兴奋性突触传递中，调节激光强度以诱发20至50皮安的突触电流。