建立用于犁鼻感觉神经元电生理记录的全细胞膜片钳技术

取一只表达荧光标记感觉神经元的转基因小鼠的化学感受性副嗅觉器官的冠状切片。

感觉上皮含有这些被标记的神经元，它们暴露于与鼻腔相连的管腔中，以感知化学信号。

使用切片固定器将切片固定在成像室中。

将记录室转移至记录装置中，并灌注含氧的细胞外溶液以维持组织活性。

将灌流微量移液管置于切片附近以引入化学刺激，并将记录微量移液管置于感觉神经元上方。

使用荧光显微镜识别标记的神经元。

施加正压以防止移液管堵塞，并靠近神经元直至细胞膜上形成凹陷。

切换至负压，将膜吸入移液管中。

施加负压以破裂膜并建立与细胞质的连续性，称为全细胞膜片钳，从而可引入化学刺激并记录由此产生的电生理信号。

将VNO切片转移至成像室，并使用带有0.1毫米厚合成纤维的不锈钢锚固定切片位置。切勿用合成纤维丝覆盖组织切片。随后，将成像室转移至记录装置，并在室温下持续用充氧的S2溶液灌流切片。

调节吸液毛细管至溶液表面，以实现灌流液的持续交换。然后，将8合1多通道灌流笔调整至靠近犁鼻器切片非感觉区域（含血管部分）的上方。随后，使用内含150 mmol/L氯化钾的L形琼脂桥连接参考电极与灌流液。

随后，用移液管溶液 S4 填充膜片移液管。将移液管安装至连接于探头阶段的氯化银涂层电极上，注意不要刮除涂层，并牢固固定。然后，在移液管进入浴液前，对其施加轻微的正压。监测移液管电阻，确保其阻值在 4 兆欧姆至 10 兆欧姆之间。

使用CCD相机结合优化的红外微分干涉差（DIC）技术观察VNO切片，并通过荧光照明和合适的滤光立方体识别表达FPR-rs3-i-Venus的细胞或类似标记的神经元。使用手轮调节以获得最大灵敏度，接近细胞体。由于正压的存在，当移液管尖端靠近细胞体膜时，细胞膜上会出现微小的凹陷。

然后，释放正压并施加轻微负压以吸入细胞膜，从而形成1至20吉欧姆的高阻封接。随后，施加短暂而轻柔的吸力破坏细胞膜，建立全细胞记录模式。