记录神经元-星形胶质细胞共培养体系中神经网络的电生理活动

从一个多电极阵列（MEA）板开始。每个孔的中央位置均包含一个电极阵列。

该阵列涂有培养基质，以促进细胞黏附。

将运动神经元和星形胶质细胞的悬液以液滴形式加入阵列上方。

孵育以促进细胞贴壁，然后加入含有小分子的预热共培养基，以维持细胞活力。

孵育期间，星形胶质细胞分泌促进神经元成熟和突触形成的因子，从而形成神经元网络。

将MEA置于记录设备中，在生理条件下监测神经元活动。

神经元传递称为动作电位的电信号，这些信号沿其轴突传播。

当信号到达突触时，会触发神经递质的释放，从而将信号传递至下一个神经元。

每个孔中的电极可记录由突触连接的神经元产生的细胞外信号。

同步节律性电信号的检测证实了神经元网络的形成。

在铺板当天或前一天，开始包被24孔MEA板。首先将PLO用去离子水或PBS稀释，然后向每孔加入15至20微升PLO，使液体在孔中央形成液滴，覆盖电极区域，注意移液枪头不要损伤电极。

向隔室周围的孔中加入水，以确保足够的湿度，并将PLO在37摄氏度下孵育1至2小时。然后，使用塑料微量移液器吸头尽可能吸除PLO溶液，注意不要触碰到电极。接着，用250微升水清洗孔板，重复三次。

使用移液枪枪头尽可能吸除水分，并在打开盖子的情况下让表面干燥。接着，加入15至20微升稀释后的层粘连蛋白，以覆盖每个电极阵列。向湿度槽中加入水并盖上盖子后，在37摄氏度下孵育至少两小时，最长可过夜。

铺板当天，用 PBS 将运动神经元和星形胶质细胞培养物各冲洗一次后，加入 0.05% 胰蛋白酶，于 37 摄氏度孵育约 5 分钟以使细胞脱落。将细胞收集至含有胰蛋白酶抑制剂的 15 毫升锥形管中，并用培养基或基础液冲洗培养板，确保所有细胞均被收集。

通过离心沉淀细胞，然后使用1,000微升移液器，用含有20微摩尔ROCK抑制剂的共培养基重悬运动神经元和星形胶质细胞，制备成1毫升单细胞悬液。使用血细胞计数板对运动神经元和星形胶质细胞进行计数；计数过程中，将细胞悬液加盖后置于4摄氏度的泡沫塑料架上。

将两种细胞悬液各取1毫升，在300 × g 条件下离心5分钟。计算所需体积，重新悬浮沉淀。按相等比例取适量神经元和星形胶质细胞悬液，轻轻吹打混匀两次，充分混合。

然后，从培养板的每个孔中移除层粘连蛋白，并将10微升终末混合的细胞悬液转移至每个孔中，形成覆盖电极阵列的小液滴。将培养板置于37摄氏度孵育20至30分钟，使细胞液滴保持静止，以促进细胞在孔板上的初始贴附。

然后，沿每个孔的孔壁加入250微升含有ROCK抑制剂的预温共培养基，再在每个孔的对侧孔壁加入相同体积的培养基，将培养板置于37摄氏度孵育24至36小时。次日，观察培养板中是否有碎片或死亡细胞，如有需要，更换为含ROCK抑制剂的新鲜共培养基。

否则，从共培养第2天开始，每周进行两次半量换液，使用不含ROCK抑制剂的共培养培养基。为进行记录，应在共培养第1天后尽快开始，将温度设置为37摄氏度，二氧化碳浓度设置为5%。然后将培养板转移至记录仪器中，平衡至少5分钟后再开始记录。根据实验设计，每隔一天或每周记录一次基础活性，每次持续1至15分钟。