小鼠脑血管内皮细胞中细胞内钙离子与膜电位的同步测量

取小鼠大脑后动脉的节段。

加入酶溶液孵育，以降解组织基质，使细胞松散。

用缓冲液替换溶液，然后将一段组织转移至记录室。

机械分离结缔组织和平滑肌细胞层，分离出下方的内皮管。

固定试管，移除解离的各层，并加入生理缓冲液。

将腔室置于具有连续缓冲液流动的记录系统中。

引入一种可进入内皮细胞的荧光钙指示剂，然后将记录电极插入细胞中。

给予一种能够触发钙离子内流并诱导内质网钙释放下游信号通路的药物。

该指示剂与钙结合后，在激发时会发出荧光。

钙离子浓度升高会激活钙依赖性钾通道，导致钾离子外流并改变膜电位。

通过荧光信号和电极同时记录细胞内钙离子浓度和膜电位的变化。

在此操作中，使用显微镜、相机和固定有腔室及显微操作器的铝制载物台，组装匀浆装置。将连接泵控制器的微量注射器固定在载物台和样本旁边。接着，用矿物油完全充满匀浆移液管，并将其固定在微量注射器活塞上方。

然后，使用带有泵控制器的微量注射器，将约130纳升解离溶液吸入移液管中，并确保无气泡存在。随后，将完整的动脉节段放入含有规定浓度酶的1毫升解离溶液中，置于10毫升玻璃试管内。

在34摄氏度下孵育10至12分钟以进行部分消化。消化完成后，将酶溶液更换为5毫升新鲜的解离溶液。使用1毫升移液器，将一个组织片段转移至含有室温解离溶液的容器中。

接下来，将移液管插入灌流室内的解离溶液中，并将其置于消化后血管的一端附近。在泵控制器上设置每秒2至5纳升的流速，以进行轻柔吹打。在100至200倍显微镜放大下，反复吸取和推出动脉节段，以分离平滑肌细胞，同时形成内皮管状结构。

如有必要，小心使用尖头镊子将分离的外膜和内弹性膜从内皮管中分离出来。确认所有平滑肌细胞均已分离，仅剩内皮细胞保持完整的管状结构。

使用显微操作器，用硼硅酸盐玻璃固定移液管将内皮管的两端固定在灌流室的玻璃盖玻片上。洗去腔内的离解外膜和血管平滑肌细胞，并将离解液更换为含 2 mM 氯化钙的生理盐溶液（PSS）。

将固定有内皮管的移动平台转移至灌流实验装置的显微镜上。然后，在实验过程中使用六个洁净的50毫升储液器，持续灌注PSS溶液及相应的药物溶液。

使用在线流量控制阀手动调节流速，使其保持与层流一致，并使进样流速与真空抽吸相匹配。在记录背景数据和染料加载之前，向腔室输送PSS至少五分钟，以对内皮管进行灌流。

为了同时测量膜电位和细胞内钙离子浓度，需拉制尖锐的电极，并用两摩尔的氯化钾反向填充，以记录加载了Fura-2染料的细胞。

研究细胞间耦联 通过 染料传递，用含0.1%碘化丙啶的两摩尔氯化钾溶液反向填充微电极。接着，将电极置于移液器架上，移液器架连接至固定在显微操作器上的电位计头级，其中银丝表面涂有氯化物。

通过4倍物镜观察，使用显微操作器将电极尖端短暂地置于灌流 chamber 中的PSS液流内。随后，将静息膜电位设定为零，以与接地的浴液电位保持一致。

如有需要，可使用与静电计相连的可听基线监测器，将声音音调与电位记录相关联。随后，使用40倍物镜将放大倍数增加至400倍，并将电极尖端置于内皮管细胞正上方。

使用光度测量软件调整光度测量窗口，使其聚焦于约50至80个内皮细胞。然后，利用显微操作器将电极轻柔地插入内皮管中的一个细胞，并等待至少两分钟，使静息膜电位稳定。

当静息膜电位稳定在预期值后，在无光照条件下打开荧光界面的光电倍增管，通过交替使用340和380纳米波长激发Fura-2，同时在510纳米处采集荧光发射信号，开始记录细胞内钙离子浓度。

建立膜电位与细胞内钙离子浓度的同时测量后，先以恒定的层流速率用PSS对内皮管进行约五分钟的灌流，然后再施加药物。

以恒定流速将用PSS配制的药物加入灌流室。在药物处理期间，同时测量F340/F380比值的膜电位。实验结束后，将电极从细胞中撤出。随后，停止膜电位和细胞内钙浓度的相应记录，并保存文件以供数据分析。