总RNA的分离和下游下一代测序和基因表达谱的非激光捕获显微切割离散小鼠脑地区显微镜方法

本实验的总体目标是以可重复、一致、经济高效且无RNase污染的方式，从特定脑核团中提取总RNA。首先需准备一个无RNase污染的工作环境，并从小鼠断头后取出完整脑组织。随后，使用微米级操作的组织切片机对脑组织进行连续切片，以获得厚度均一的组织切片。

然后，在保持组织处于无RNA酶环境的条件下，使用特定直径的组织钻孔工具对目标脑区进行显微解剖。最后，从切除的脑核团中提取总RNA。最终可获得足够产量和质量的总RNA，用于后续的cDNA文库构建及通过分光光度法或荧光定量法进行转录组分析。

与现有的整体解剖学或激光捕获显微切割辅助的脑区切除方法相比，该技术的主要优势在于，能够以可重复且成本效益较高的方式，从单个小鼠脑中收集多个离散的感兴趣脑区。该方法有助于回答神经科学领域中的关键问题，例如，与非神经元回路相关的脑区内不同的转录表达谱是否可能与特定行为特征、环境反应和（或）疾病状态相关。为进行显微解剖，向100毫升Earl's平衡盐溶液（EBSS）中加入0.44克碳酸氢钠和0.884克葡萄糖。

在可高压灭菌的带螺口盖的瓶或烧瓶中，用 0.1 毫升 DEPC 处理 EBSS，处理时间至少为 12 小时，温度为 37 摄氏度。将 5¾ 英寸玻璃移液管放入 1 升玻璃烧杯中，并将毛刷的刷毛朝上放入 100 毫升玻璃量筒中。

加入足量经DEPC处理的水溶液以浸没移液器和刷子。用铝箔覆盖烧杯和量筒，在37摄氏度下孵育至少12小时。经DEPC处理12小时后，将所有经DEPC处理的材料加热至100摄氏度以上，持续至少15分钟，然后冷却。在4摄氏度保存前，将EBSS冷却至室温。

将去离子水从烧杯和量筒中倒出，继续在高于100摄氏度的条件下孵育，直至材料完全干燥。从孵育器中取出后，于室温下冷却，并保存以备后续使用。实验当天，对所有工作表面进行处理以去除RNase污染，并将EBSS置于40摄氏度水浴中，以进行缓冲和氧合。

用含5% CO2和95%氧气的混合气体通过RNA-free牧草移液管连接EBSS，将移液管插入EBSS中并覆盖EBSS容器开口处进行灌注。设置组织切片机以进行脑组织的连续切片。

处理组织切片机的顶部和底部表面。为去除RNA污染，将一块矩形的Watman 4号滤纸贴附在组织切片机的有机玻璃表面上。将双刃剃须刀片安装到切片臂上。

将千分尺调至零位，并调整切刀臂的最低高度，使剃刀刀片能够切割滤纸，但不能切割有机玻璃板。准备好显微解剖所需的所有其他材料，包括无RNA酶的60 mm × 15 mm细胞培养皿、200 µL无RNA酶移液器吸头、弯头剪刀、干冰以及用于组织收集的离心管。使用啮齿类动物断头器处死小鼠后，迅速取出完整脑组织（包含后脑和视神经），并将离心管置于干冰上。

将脑组织放入一个无RNA酶的60 × 15毫米细胞培养皿的上部，然后转移至组织取样操作台。使用无RNA酶的移液器，小心地用EBSS润湿固定在组织切片机上的滤纸。

用EBSS润湿脑组织。将脑组织转移至组织切片机上，使其腹面贴附于滤纸。脑组织的中线应垂直于切片刀刃，脑的前端边缘紧贴刀片。

使用经 A-D-E-P-C 处理的画笔，轻轻按压脑组织背侧表面，以固定脑组织。将刀片架杠杆抬高至背侧组织表面以上约四到五厘米处，并保持在此位置。从脑组织表面移开画笔，然后调节至 750 微米。

使用千分尺。让杠杆下落，切割组织，同时切片刀保持静止，从而制备出750微米的冠状切片。用画笔以滚动的方式轻轻将组织切片从刀片表面移开。

立即将组织切片放入培养皿中充氧的EBSS中。该切片现已准备好进行显微解剖。重复切片操作，直至在整个前后平面上获得连续的脑切片，以进行显微解剖。

首先，检查光照条件，确保样品照明不会受到遮挡。调节 O2 CO2 混合气体的位置和流量，以维持组织的缓冲含氧环境。在操作过程中，识别包含目标区域的冠状脑切片，并使用画笔将其平整地放置在培养皿底部。

选择合适直径的组织芯取样器。用画笔固定住冠状组织切片，将组织芯取样器的切割端垂直对准组织切片表面。在施加压力的同时，将组织芯取样器的尖端压穿组织切片，并牢固地压至培养皿底部。

采用滚动式环形运动，确保目标区域已从周围组织中分离。小心地将组织核心从组织切片上提起，并用画笔轻柔操作，使微切割组织脱离并悬浮于EBSS中。立即将组织微切割样本放入盛有干冰、保存于-80摄氏度的稳定储存管中。

组织应易于粘附在管壁上。将含有微切割样品的管子放回干冰中。对每个感兴趣的脑区重复此显微切割操作。

微解剖完成后，记录每个含有样本的试管对应的标签或条形码。将组织样本置于-80摄氏度冰箱中保存，直至进行RNA提取。首先，准备一个无RNA酶的工作环境。

根据总RNA提取试剂盒说明书中的说明，配制足量的磁珠混合液和裂解结合溶液。将组织样本从-80摄氏度冰箱中取出，立即将离心管置于干冰上。向样本管中加入100 µL裂解结合溶液。

将无核酸酶的0.5毫升管规格研磨杵连接至沉淀混合器，使用低吸附无核酸酶吸头匀浆组织。立即用同类型吸头将匀浆后的样品转移至圆底96孔细胞培养板的孔中。向样品中加入60微升100%异丙醇。

向样品中加入20 µL珠子混合液，通过上下吹打3至4次混匀。按照总RNA提取试剂盒的说明书步骤完成总RNA提取。最后，测定所得总RNA的纯度和浓度。来自不同脑区显微穿刺样本的总RNA数据如本表所示。

使用30微升裂解缓冲液处理的RNA样本可获得足够的总RNA，适用于市售的用于RNA测序应用的cDNA文库构建试剂盒。此外，RNA得率及260/280比值均为来自相应显微切割样本的单次检测值，用以展示各脑区样本的检测结果，证实样本纯度较高。一旦掌握该技术，若操作得当，可在8至10分钟内完成。在进行该操作时，必须注意仅使用无RNA酶的耗材或经DEPC处理的材料，以最大限度降低工作台面或组织样本受到RNA污染的风险。