总RNA的分离和下游下一代测序和基因表达谱的非激光捕获显微切割离散小鼠脑地区显微镜方法

该程序的总体目标是以可重复、一致、成本效益高且无 RNA 的方式从离散的脑核中收集总 RNA。这是通过首先准备一个无 RN 的工作环境并从被斩首的小鼠中取出整个大脑来实现的。接下来，使用千分尺作的组织切碎机切割大小均匀的连续组织切片。

然后使用固定直径的组织核心对感兴趣的大脑区域进行显微解剖，同时将组织保持在无 RNA 的培养基环境中。最后，从切除的脑核中分离出总 RNA。最终，通过光谱光度或荧光测定法，可以获得足够的总 RNA 产量和质量，用于下游 CDNA 文库制备和转录组分析。

与现有方法（如大体解剖或激光捕获显微镜辅助脑区切除）相比，该技术的主要优点是可以以可重复且成本足够的方式从单个小鼠大脑中收集多个离散的感兴趣大脑区域。这种方法可以帮助回答神经科学领域的关键问题，例如与无神经元回路相关的大脑区域内的不同转录表达谱是否可能与某些行为特征、环境反应和/或疾病状态相关。为了准备显微解剖，在 100 毫升 Earl 平衡盐溶液或 EBSS 中补充 0.44 克碳酸氢钠和 0.884 克葡萄糖。

在可高压灭菌的瓶子或带螺口的烧瓶中用 0.1 毫升 DEPC 处理 EBSS 至少 12 小时。在 37 摄氏度。将 5 英寸和 3/4 英寸的玻璃移液器放入 1 升玻璃烧杯中，然后将刷毛朝上的艺术家画笔放入 100 毫升玻璃量筒中。

加入足够的 DEPC 处理过的水溶液以覆盖移液管和刷子。用铝箔盖住烧杯和量筒，在 37 摄氏度下孵育至少 12 小时，然后与 DEPC 一起孵育 12 小时，加热所有 DEPC 处理过的材料，使其温度高于 100 摄氏度至少 15 分钟。凉。EBSS 在室温下储存，然后在 4 摄氏度下储存。

将 DD H2O 从烧杯和量筒中倒出，并在 100 摄氏度以上继续孵育，直到材料干燥。将它们从培养箱中取出，在室温下冷却并储存以备后用。在实验当天，处理所有工作表面以去除 RNA 污染位置，并将 EBSS 保持在 40 摄氏度的水浴中以缓冲和充氧。

EBSS 通过将气体管放入无 RNA 的牧草移液管中，用 5% CO 2 和 95% 氧气渗透它。并将移液器插入 EBSS，盖上 EBSS 容器的开口。设置组织切片机，对脑组织进行连续切片。

处理组织切片机的顶面和底面。为了去除 RNA 污染，将一块矩形的 watman Number 4 滤纸贴在组织切碎机的有机玻璃表面上。将双刃剃须刀片连接到切碎臂上。

将千分尺设置为零并调整切碎臂的最小高度，以允许剃须刀片切割滤纸，但不能切割有机玻璃板。收集显微解剖所需的所有额外材料，包括不含 RNA 的 60 x 15 毫米细胞培养皿、200 μL 不含 RNA 的微量移液器吸头、弯曲的剪刀、干冰和用于组织采集的试管。使用啮齿动物断头台将小鼠斩首并取出整个大脑，后脑和视神经完好无损，将试管放在干冰上。

将大脑放入 60 x 15 毫米的无 RNA 细胞培养皿的顶部。然后将其转移到组织采样工作台面上。使用不含 RNA 的移液器用 EBSS 保守地润湿附着在组织切碎机上的滤纸。

用 EBSS 润湿脑组织。将大脑转移到组织切碎机上，并将其放置在腹面上，使其位于滤纸上。垂直于切碎刀片的中线和与刀片相邻的大脑的喙缘。

使用 A-D-E-P-C 处理的艺术家刷，在保持大脑静止的同时，对大脑的背表面施加轻柔的压力，使大脑保持静止。将刀架杆抬起背组织表面约 4 到 5 厘米，并将其保持在该位置。从大脑表面取下刷子并拨出 750 微米。

使用千分尺。让杠杆下降，切碎组织并创建一个 750 微米的冠状切片，同时切碎刀片保持静止。使用艺术家的画笔进行滚动动作，轻轻地将组织切片从刀片表面滑开。

立即将组织切片放入培养皿中的含氧 EBSS 中。该切片现在可以进行显微解剖。重复切片程序，直到在整个 rost codal 平面上获得连续的脑切片以进行显微解剖。

首先，检查照明以确保样品照明不会受到阻碍。调整 O2 CO2 混合物的位置和流量，以保持组织的缓冲含氧环境。在此过程中，确定包括感兴趣区域的冠状脑切片，并使用艺术家的画笔将其平放在培养皿的底部。

选择具有适当直径的组织核心。用艺术家的刷子将冠状组织切片固定到位，然后将组织核心的切割尖端向下放在组织切片的表面上。在施加压力的同时，将组织核心尖端压过组织切片并向下牢固地压在培养皿的底部。

使用滚动圆周运动以确保感兴趣区域已与周围组织分离。小心地将组织核心从组织切片上提起，并使用艺术家刷子释放微型冲头，使其漂浮在 EBSS 中。立即将组织微型打孔器放入保存在干冰上的零下 80 摄氏度稳定储存管中。

组织应易于粘附在管的侧面。将含有微量样品的试管放回干冰中。对每个感兴趣的大脑区域重复此显微解剖。

显微解剖完成后，记录每个包含试管的样品的相应标签或条形码。将组织样品放入零下 80 摄氏度的冰箱中，直到提取 RNA 以从组织样品中提取 RNA。首先，准备不含 RNA 的工作区。

按照总 RNA 分离试剂盒手册中的说明制备足量的磁珠混合物和裂解结合溶液。从零下 80 摄氏度的冰箱中取出组织样本，并将试管直接放在干冰上。将 100 μL 裂解结合溶液添加到一管样品中。

将不含核酸酶的 0.5 mL 管大小的研杵连接到沉淀混合器上，并使用低保留无核酸酶的移液器吸头对组织进行均质化。立即使用相同类型的吸头将匀浆样品转移到圆底 96 孔组织培养板上的孔中。向样品中加入 60 微升 100% 异丙醇。

向样品中加入 20 μL 微珠混合物，上下吹打 3 至 4 次进行混合。按照总 RNA 分离试剂盒方案步骤完成总 RNA 提取。最后，测量所得总 RNA 的纯度和浓度 来自各个大脑区域的微穿孔的数据如下表所示。

含有 30 μL 进化缓冲液的 RNA 样品提供了足够的总 RNA，可用于用于 RNA 测序应用的市售 CD NA 制备产品。此外，RNA 产量和两个 60 比两个 80 的比率是从相应的显微解剖样品中获得的单个值，以证明从每个大脑区域获得的读数，它们证实了高样品纯度一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在 8 到 10 分钟内完成。在尝试此程序时，请务必记住，仅使用不含 RNA 或经过 dsy 处理的材料，以最大限度地降低工作表面或组织样品的 RNA 污染风险。