检测果蝇感觉神经元的生理反应

将麻醉的转基因黑腹果蝇侧放在盖玻片上。

伸展其前腿并固定它们以露出跗节。

这些片段具有表达以钙结合形式发出荧光的钙指示复合物的味觉神经元。

苍蝇周围画一个疏水屏障以保留溶液。

让苍蝇恢复并将缓冲盐水溶液覆盖在暴露的睑节上以润湿它们。

在共聚焦显微镜下，观察跗骨段并在不同深度对味觉神经元进行成像，以获得刺激前荧光。

将含有亲脂性配体的刺激溶液添加到片段上。

这些配体与味觉神经元受体结合，启动信号通路并触发钙通道的打开。

这使得细胞外液中的钙离子进入细胞质并与钙指示剂复合物结合，从而产生荧光发射。

再次观察时，神经元荧光的增加证实了神经元对配体的生理反应。

蝇后，使用一小滴透明指甲油将其贴在 0.17 毫米的盖玻片上。使用整个水滴将苍蝇的侧面连接到滑梯上。接下来，在解剖显微镜下，使用湿画笔伸展苍蝇的前腿。然后，使用两条非常细的胶带，将第一和第五跗节固定到盖玻片上。

如果要对长鼻中的神经元进行成像，则在长鼻的喙上放置另一条细胶带以暴露唇瓣。现在，使用 PAP 笔在苍蝇周围做一堵短墙。在进行测量之前，让麻醉消退半小时。对于该协议，使用 PBST 制备 1 毫克/毫升储备配体溶液的必要稀释液。

要开始该过程，将 10 微升 PBST 覆盖在固定和暴露的跗骨段上。这可以滋润腿部并防止其失焦。接下来，使用光学系统关注片段，该系统可以获得具有快速时间分辨率的良好荧光信号，例如带有sCMOS相机的转盘共聚焦显微镜。收集跗节段中感兴趣神经元的三个刺激前 Z 堆栈。

在此示例中，图像以 200 毫秒的曝光和每两秒在 6 微米 x 1/2 微米部分进行 2 x 2 合并捕获。请务必优化激光器的功率，以最大限度地减少光漂白，同时仍允许高信噪比。在这里，一个 491 纳米、100 毫瓦的激光器以 30% 的透射率运行。

必须在刺激前可检测到，但不能接近饱和。现在，将 10 微升刺激溶液移液到感兴趣的跗骨段上。移液时，要非常小心，避免接触腿或苍蝇的任何身体，否则跗骨会移位。然后，立即获取第一张刺激后图像，并继续收集足够的图像以记录荧光的最大变化。