0 次观看 • 3:41 分钟 • July 8th, 2025
将一只侧卧的麻醉后转基因黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）固定在盖玻片上。
伸展其前肢并固定，以暴露跗节段。
这些节段具有表达钙离子指示剂复合物的味觉神经元，该复合物在结合钙离子时会发出荧光。
在果蝇周围绘制一个疏水屏障以保留溶液。
让果蝇恢复，并将缓冲盐溶液覆盖于暴露的跗节段上以保持其湿润。
在共聚焦显微镜下观察跗节节段，并在不同深度对味觉神经元进行成像，以获得刺激前的荧光信号。
将含有疏水性配体的刺激溶液加入到该片段上。
这些配体与味觉神经元受体结合，启动信号通路并触发钙通道的开放。
这使得细胞外液中的钙离子进入细胞质，并与钙指示剂复合物结合，从而产生荧光发射。
再次观察时，神经元荧光的增强证实了神经元对配体的生理学反应。
将果蝇麻醉后，用极少量透明指甲油将其固定在0.17毫米的盖玻片上。将整滴指甲油用于将果蝇的侧面粘附到玻片上。接着，在解剖显微镜下，用湿润的画笔伸展果蝇的一条前足。然后，使用两条极细的胶带，将第一和第五跗节段固定在盖玻片上。
如果需要对喙部的神经元进行成像，则在喙的吻部再贴一条细胶带，以暴露唇瓣。接着，使用PAP笔在果蝇周围制作一个短壁。在开始测量前，让麻醉作用消退半小时。对于本实验方案，使用PBST配制必要稀释倍数的1毫克/毫升母液配体溶液。
开始操作时，将10微升PBST覆盖在固定并暴露的跗节段上。这可以润湿腿部，防止其偏离焦点。接下来，使用能够以快速时间分辨率获得良好荧光信号的光学系统（如配备sCMOS相机的转盘共聚焦显微镜）对准节段。采集跗节段中目标神经元的三组刺激前Z轴层扫图像。
在此示例中，每两秒对一个6微米×1/2微米的区域进行一次成像，曝光时间为200毫秒，并采用2×2像素合并。请务必优化激光功率，在保证高信噪比的同时尽量减少光漂白。此处使用波长为491纳米、功率为100毫瓦的激光，其透射率设置为30%。
刺激前必须能够检测到信号，但信号不得接近饱和状态。现在，用移液器将10微升刺激溶液滴加到目标跗节段上。移液时需格外小心，避免触碰果蝇的腿部、身体或其他部位，否则跗节会移出原位。随后立即采集第一张刺激后图像，并持续采集足够数量的图像，以记录荧光强度的最大变化。