微电极介导的FM染料加载与卸载 果蝇 幼虫神经细胞

从黑腹果蝇（Drosophila）幼虫开始，将其肌肉和神经纤维暴露，并浸入含有荧光膜染料（即FM染料）囊泡的溶液中。

FM染料与细胞膜中的脂质结合，在其表面形成一层荧光涂层。

使用显微操作仪，在显微镜下将吸吮微电极尖端定位至目标位置。

聚焦于神经纤维和微电极。

利用负压将神经纤维的一段环路吸入微电极中。

施加电流脉冲以刺激神经纤维。

这会触发运动神经元与肌纤维连接处的神经肌肉接头，从而启动突触小泡的内吞作用。

在此过程中，细胞吞噬被FM染料包被的膜，形成染色的内吞囊泡，非常适合用于观察神经递质传递的突触前阶段。

洗去FM染料，并更换外部溶液。

施加电流脉冲以将 FM 染料标记的囊泡从细胞中卸载出来。

进行电刺激时，使用微电极拉制仪制备一根尖端具有适当锥度和尺寸的吸液微电极。随后，使用微电极抛光仪对微电极尖端进行灼烧抛光，以便在吸附单根运动神经时形成紧密贴合。

将吸管移液器滑入安装在显微操作仪上的电极夹持器中，该移液器连接着一根长的柔性塑料管和一个注射器。接着，将带有FM染料的标本置于显微镜载物台上，并升高载物台，直至幼虫和吸管移液器处于焦点位置。

然后，使用注射器产生的负压将支配选定半节段的切断运动神经环吸入至吸电极中。随后，利用选定的参数刺激运动神经，以驱动突触小泡内吞及FM1-43染料的摄取。

在此操作过程中的最关键步骤是将单根运动轴突紧密地吸入吸管电极中。这可能需要经过多次尝试才能成功。一旦找到合适的吸管电极，应在所有待比较的实验条件下使用同一个电极，以确保刺激强度的一致性。

进行FM染料卸载时，将同一运动神经吸入同一电极中，然后刺激该运动神经以激活突触小泡的胞吐作用并释放FM1-43染料。