分析突触小泡循环与荧光染料摄取 黑腹果蝇 幼虫

将一只活的 Drosophila 幼虫神经肌肉标本置于含有无钙生理盐水的记录室中。

幼虫神经元表达一种光敏感性阳离子通道。

更换为含有荧光染料的加钙盐水。

该染料在未被内吞时荧光较弱，但在被神经元内吞后荧光显著增强。

用蓝光照射幼虫。

这会激活通道，引起阳离子内流和神经元去极化，从而启动动作电位。

动作电位到达神经肌肉接头处的突触末梢，引起钙离子内流和囊泡胞吐。

随后，染料结合的膜在囊泡回收过程中被内化。

用无钙盐溶液洗涤，以终止囊泡循环并去除任何未内化的染料。

观察荧光信号。

接下来，加入无染料且添加了钙的生理盐水，并再次进行照射。

这会引发另一个动作电位、钙离子内流以及含染料囊泡的胞吐作用。

再次可视化信号。

由于囊泡胞吐作用导致的染料释放会降低荧光强度，与囊泡内化期间的状态相比有所下降。

对于通道视紫红质刺激，使用同轴电缆将蓝色LED连接至可编程刺激器，并将LED放入相机接口。利用显微镜的变焦功能，将蓝色LED光束聚焦到含有FM染料的标本上。

在此步骤中最关键的是确保 LED 设置保持恒定，并且在所有待比较条件下，对每个动物的相同部位进行照射，以保证刺激强度的一致性。

启动光刺激，并使用计时器追踪光遗传刺激预设的持续时间。当计时器结束时，迅速移除FM染料溶液，并替换为无钙任氏液以终止突触囊泡循环。对于FM染料卸载，启动光刺激并使用计时器追踪光遗传刺激预设的持续时间。当计时结束时，迅速移除FM染料溶液，并替换为无钙任氏液以终止突触囊泡循环。