0 次观看 • 3:54 分钟 • July 8th, 2025
将含有表达光依赖性离子通道和荧光报告蛋白的胚胎肾细胞的盖玻片置于硅胶包被的测量室中。封闭后加入外部缓冲液。
将此腔室置于显微镜下。放置充满琼脂的浴电极。用缓冲液灌注以去除残留培养基和死细胞。
使用荧光滤光片识别并聚焦目标细胞。
将膜片钳电极连接至显微操作器。施加正压以防止堵塞，并靠近细胞。
将移液管置于细胞附近，释放正压，以在尖端形成膜片。
形成膜片后，施加负压以破裂膜。
施加特定波长的光以打开离子通道。电极将记录离子移动所产生的电压变化。
首先，用硅胶密封测量室，以防止外部缓冲液泄漏。然后，将一张盖玻片放入测量室中并关闭。小心地用细胞外缓冲液填充测量室，以防止细胞脱落。随后，将测量室置于显微镜下，使用40倍物镜观察细胞。
接下来，将琼脂桥置于浴槽电极上方，并将其与液面传感器及灌流出口一同放入记录腔室中。用 1 毫升新鲜细胞外液更换两次细胞外溶液，以去除残留的培养基和脱落的细胞。将细胞调至清晰对焦状态，并寻找一个转染细胞，该细胞需与其他细胞分离。然后，使用三通滤光片组和橙色光激发并观察 mCherry 荧光信号。
将移液管安装在移液管架上，并施加一定的正压以防止吸头堵塞。在显微镜下找到膜片钳移液管的尖端，使用显微操作器将其移动至细胞附近。
在数据采集软件中，以浴液模式启动膜测试并施加电压阶跃。检查移液管电阻是否处于期望的 1.3 至 3.0 兆欧范围内。然后，将偏移电流归零，并通过调节放大器上的移液管偏移旋钮来调整移液管电位。
建立全细胞记录构型时，从上方缓慢移动记录电极接近细胞，并在接触细胞前立即释放正压。通过调节电极电容补偿旋钮，使测试脉冲的响应呈平坦状态，以补偿电极电容。
将膜片钳模式切换至细胞模式。然后通过施加短暂的负压脉冲或强度逐渐增加的负压，使细胞膜破裂，但不破坏封接，从而获得全细胞构型。
通过设置全细胞模式下的两个参数——细胞电容和串联电阻，开始串联电阻补偿。在不同的钳制电位下记录光诱导电流。该图显示，在绿光照射期间，PSACR1表现出一个快速的瞬时电流，该电流迅速衰减至一个稳定的电流水平。