小鼠耳蜗特定频率区域带状突触的评估

从含有经预处理的小鼠耳蜗转的试管开始，其中加入透化剂和封闭剂，以防止非特异性相互作用。

每一圈均能检测不同的声音频率，并含有将声音转化为电信号的毛细胞。这些信号被传递 通过 神经递质在听觉神经的带状突触中的传递。

移除溶液，加入与毛细胞和神经细胞在带状突触处的蛋白质相互作用的一抗，然后洗涤。

使用标记红色和绿色荧光染料的二抗进行孵育，使其与一抗结合。

洗涤以去除未结合的二抗。

将样本置于载玻片上，加入含核染料的封片介质，使细胞核染成蓝色。

安装盖玻片，干燥后使用共聚焦显微镜对每个片段在不同深度进行成像。

带状突触表现为紧密相邻的红色和绿色斑点。

在每一圈中计数这些功能性斑点，以将其反应与声音频率相关联。

解剖后，将每个耳蜗转放入单独的2.5毫升离心管中。在旋转仪上，用含0.1% Triton X-100的PBS配制的10%山羊血清于室温孵育1小时，以阻断非特异性结合。

孵育结束后，在解剖显微镜下使用200微升移液器吸头移除溶液。将标本与目标一抗在含5%正常山羊血清和0.1% Triton X-100的PBS缓冲液中稀释后，于4摄氏度旋转孵育过夜。

次日早晨，用冰冷的0.1摩尔PBS溶液将组织样本清洗三次，每次5分钟，以去除残留的一抗。随后，在避光条件下，将样本置于摇床上，用含5%正常山羊血清和0.1% Triton X-100的PBS溶液稀释的适当二抗室温孵育2至3小时。

孵育结束后，如图所示用 0.1 摩尔 PBS 洗涤样品三次，并将标本转移至含有 0.1 摩尔 PBS 的独立 35 毫米培养皿中。在载玻片上滴加一滴含 DAPI 的封片剂，然后将标本从 PBS 中转移至封片剂中。将盖玻片的一边接触每张载玻片，然后松开，使盖玻片轻轻盖下。随后，将载玻片置于载片盒中，在 4 摄氏度下过夜干燥。

为了成像样本，使用配备适当激光器和63倍高分辨率油浸物镜的共聚焦显微镜。从每个耳蜗转角获取8微米的共聚焦z轴堆栈图像。对于突触斑点计数，将z轴堆栈的步长设为0.3微米，以覆盖整个内毛细胞的长度，确保所有突触斑点均能被成像，并将包含斑点的图像在堆栈中合并，获得z轴投影图像。

将合并后的图像导入合适的图像处理软件程序。将每个z轴堆栈在特定频率区域的突触总数除以DAPI阳性内毛细胞的数量，以计算每个细胞的突触斑点数量。在每个特定频率区域，对包含9至11个内毛细胞的3个不同显微视野图像中的所有突触斑点取平均值。

为了更清晰地观察细胞骨架结构和突触定位，使用画笔工具直观评估单个内毛细胞的突触结构及其分布情况。为观察突触前带状体与突触后受体斑块的相对位置关系，可使用矩形选框工具提取带状体周围体素空间，并通过图像切割分离单个带状体。随后，点击图像和图像大小，生成这些微小投影的缩略图阵列，用于区分成对的突触与孤立的带状体（orphan ribbons）。