Name: 在早期鸡胚跟踪形态组织变形 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: 了解早期鸡胚形态组织变形的高分辨率追踪技术，学习使用荧光脂溶性染料或聚苯乙烯微球进行表面标记，结合荧光显微镜和光学相干断层扫描成像，实时分析组织伸长、缩短和剪切应变。

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本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）R01 GM075200 和 R01 HL083393（LAT）基金的支持。我们感谢美国国立卫生研究院 T90 DA022871 项目以及 Mallinckrodt 放射学研究所为 BAF 提供的博士后资助，以及美国心脏协会 09PRE2060795 项目为 VDV 提供的资助。

1. 一般实验准备
<ol>
	<li>在超净工作台中配制组织培养用培养基。
		<ol>
			<li>稀释杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）（1 L 瓶装，含 4.5 g/L 葡萄糖、碳酸氢钠和 L-谷氨酰胺），加入 10 mL 青霉素/链霉素/新霉素抗生素。</li>
			<li>用无菌移液管移除 100 mL DMEM，并加入 100 mL 鸡血清替代。</li>
			<li>将含 10% 鸡血清和 1% 抗生素的 DMEM 分装至无菌的 15 mL 锥形离心管中，冷冻保存。</li>
		</ol>
	</li>
	<li>配制含钙和镁的磷酸盐缓冲液（PBS）。将 100 mL 10× PBS、900 mL 去离子水以及 1 mL 浓缩钙镁溶液（100 mg/mL CaCl2•2H2O，100 mg/mL MgCl2•6H2O）混合均匀。</li>
	<li>将鸡蛋以纵向方向置于培养箱中孵育至所需发育阶段，依据 Hamburger 和 Hamilton1 分期标准（例如，HH 5 期约为孵育 23–25 小时，HH 11–12 期约为 42–48 小时）。</li>
	<li>采用滤纸载体法从鸡蛋中取出胚胎。
		<ol>
			<li>将鸡蛋底部轻敲于直径 150 mm 的培养皿边缘，掰开蛋壳底部，将内容物倒入培养皿中。</li>
			<li>使用钝头镊子去除蛋中较厚且黏稠的蛋清部分。</li>
			<li>裁剪直径为 2–3 cm 的 Whatman #2 滤纸圆片，使用单孔打孔器在滤纸中央打孔。将滤纸环放置于蛋黄表面，使胚胎位于环中央孔洞下方并保持可见。</li>
			<li>用显微剪刀沿滤纸外缘剪下，再用精细镊子将滤纸从蛋黄上取下。</li>
			<li>用 PBS 轻柔冲洗胚胎，以去除附着的卵黄颗粒（HH5 期胚胎可能需要浸泡 15–20 分钟以彻底清除残留卵黄）。将滤纸组件从液体中取出，置于 35 mm 培养皿中，腹面朝上。在第一层滤纸环上叠加第二个滤纸环，使胚胎夹于两环之间。在外围套上金属环（直径约 1.5–2 cm），以固定胚胎。</li>
			<li>将胚胎浸入培养基中，使用明场显微镜检查其形态是否正常及发育阶段是否准确。</li>
		</ol>
	</li>
	<li>使用拉针仪制备尖端精细的玻璃针（内径 1.5 mm）（World Precision Instruments，Sarasota FL），用于后续组织解剖和标记操作。</li>
</ol>
2. 使用磁性铁颗粒对HH 5期胚胎进行DiI标记
<ol>
<li>在室温下，向少量还原铁粉（Mallinckrodt Baker, Inc.，Phillipsburg, NJ）中加入几滴饱和的DiI酒精溶液，待其自然干燥。（通常在酒精蒸发后，颗粒会结块。）用拉制的微移液管尖端将结块的铁颗粒打散，转移至微量离心管中，用去离子水反复冲洗并浸泡。</li>
<li>为标记HH 5期胚胎的外胚层细胞，将已取出的胚胎（即整个滤纸装置）背侧朝上置于盛有足量培养基的35 mm培养皿中，并将培养皿置于解剖显微镜下。使用玻璃针去除卵黄膜，暴露外胚层细胞。（注意不要刺破胚胎。）</li>
<li>用巴斯德移液管吸取一列已标记的铁颗粒（悬浮于去离子水中）。在解剖显微镜下，将移液管尖端浸入液面以下，并置于胚胎正上方。用指尖缓慢来回滚动移液管，使颗粒从管中振落，均匀撒布于胚胎表面。</li>
<li>当胚胎表面覆盖足够颗粒后，小心将其放入37°C培养箱中孵育约10分钟。取出胚胎，使用强磁铁去除表面颗粒。</li>
<li>使用配备视频相机并设置适当滤光片的荧光显微镜，采集胚胎的明场和荧光图像，如图2A、B所示。</li>
<li>观察标记密度。若需更高密度，可重复上述操作，增加颗粒用量并相应延长孵育时间。若标记过密，可在装有已标记颗粒的微量离心管中加入少量未标记铁颗粒，混匀内容物。使用新的胚胎重复标记过程，并再次评估标记密度。</li>
</ol>
3. 用于 HH11-12 胚胎光学相干断层扫描（OCT）成像的聚苯乙烯微球标记
<ol>
<li>在35 mm的培养皿中，用PBS配制直径为10 μm的黑色微球溶液（Polysciences Inc., Warrington, PA）。（微球应足够大以在OCT成像中产生对比度，但又应足够小，使其尺寸接近单个细胞的量级。具体数值将根据所用OCT系统的分辨率和所研究的组织类型而有所不同。）通常每毫升PBS中加入一滴原液（2.6%固体含量的乳胶）即可。使用22号针头将该溶液吸入10 mL注射器中。涡旋振荡30秒，以确保微球均匀分散。</li>
<li>使用计算机硬盘片对拉制的玻璃针尖进行磨边2。针尖直径应足够大，以使微球能够通过开口，但同时应尽可能小，以尽量减少注射过程中对组织的损伤。</li>
<li>用注射器将微球溶液注入已磨边的玻璃针中。轻轻弹击微量移液管，确保溶液已到达针尖。</li>
<li>使用显微操作器，将玻璃针置于与胚胎相同的视野中。应可见微球从移液管尖端缓慢流出。<ol>
<li>若无微球从微量移液管中流出，可能是发生堵塞。此时应使用新的玻璃针重复步骤3.2–3.4。</li>
<li>若视野中微球过多形成遮蔽，则移液管尖端可能过宽。应更换新的移液管和新的胚胎，重复步骤3.2–3.4。</li></ol></li>
<li>将移液管尖端插入脑管腔内。注意不要刺穿组织的腹侧底部。当微球和液体进入管腔时，可见组织出现短暂性肿胀。这表明插管成功；此时应迅速撤出玻璃针。</li>
<li>使用明场显微镜检查脑管内腔中微球密度是否足够。在进入第4节操作前，让微球沉降20–30分钟。</li>
</ol>
4. 数据采集
* 以下方法非常适用于上述荧光标记技术。然而，在使用微球标记技术时，样品在孵育箱与成像系统之间转移过程中微珠可能发生脱落。在此情况下，最好直接进行步骤 4.2（该步骤完全避免了样品的移动或扰动）。两种方法中，胚胎均在浸没于液体培养基的条件下进行培养。如果胚胎未完全浸没（某些传统组织培养技术即存在此情况），组织几何形态会因异常高的表面张力负荷而发生显著改变，导致应变分布无法准确反映正常的三维形态发生过程3, 4。此外，将组织浸没在液体中还可防止光学相干断层扫描（OCT）成像时液-气界面产生的高对比度干扰，从而避免胚胎形态及标记物坐标的观察受到遮蔽。
<ol>
<li>胚胎培养（常规）<ol>
<li>获取首批图像（明场、荧光或OCT）后，将最多七个含有胚胎的35 mm培养皿放入一个150 mm的培养皿中，并将整个装置置于一个小塑料袋内。向袋内加入几滴去离子水以保持湿度，并用95% O2 / 5% CO2混合气体充满袋子。将胚胎置于37°C培养箱中（Queue Stabiletherm，Asheville，NC），培养至下一次成像时间点。使用此方法，可在同一天对多个胚胎进行实验。</li></ol></li>
<li>延时培养（自动化）<ol>
<li>将标记好的胚胎放入Delta T培养皿中（外径35 mm，中央孔径23 mm，带锥形侧壁，玻璃厚度0.17 mm；Bioptechs，Butler，PA），内含1.2 mL培养基。</li>
<li>用玻璃盖盖住培养皿，并使用Bioptechs Delta T4培养皿控制器将其维持在37°C（防止冷凝）。通过Mini-Pump Variable Flow装置（Fisher Scientific）提供的95% O2 / 5% CO2混合气体持续灌流胚胎。在气体到达胚胎前，将其通入置于加热板（&lt;100°C）上的去离子水中，以实现加热和加湿。该实验装置的示意图见图1。</li>
<li>设置软件以在用户指定的时间间隔自动采集图像。对于我们的荧光显微镜，使用Openlab软件（PerkinElmer，Waltham，MA）；对于OCT系统，则使用扫频光源Thorlabs软件（Newton，NJ）。由于该方法目前一次仅能处理一个延时实验，因此通常最好让此类培养过夜运行。可通过安装与成像系统的硬件和软件兼容的自动可移动载物台来克服此限制5。</li></ol></li>
</ol>
5. 代表性结果：
在每次实验中，标签通过 Volocity（PerkinElmer）自动追踪，或通过 ImageJ（NIH）中的手动追踪插件进行手动追踪。在荧光标记技术中，我们使用 Matlab 程序 gridfit 对标记点坐标拟合二维曲面，从而计算形态发生表面应变6, 7。随后采用标准公式将这些值转换至相关的胚胎坐标系中。 alternatively，在光学相干断层扫描（OCT）技术中，曲面由分割后的图像体数据生成（可通过 Matlab 或 Caret8 等标准软件获得），并可在样本最大或最小曲率方向上计算应变9。
我们采用铁颗粒标记技术，对早期鸡胚头部褶皱形成过程中外胚层细胞的运动进行标记和追踪。如图2A所示，荧光标记的细胞分布于整个胚胎。在不同时间间隔下，分别采集了胚胎的明场和荧光图像 体外 培养。随后利用追踪标记的运动（图2B、C）计算头褶形成过程中动态变化的形态发生应变分布（图2D-F）。
同样，我们采用聚苯乙烯微球技术追踪早期鸡胚脑部中脑-后脑边界处的组织运动。如图3 B-D所示， bead的运动被追踪了6小时，并根据标记物坐标计算出表征组织在纵向和周向变形的应变。需要注意的是，该方法能够处理明显的三维变形，因为bead倾向于附着在脑内腔管腔的各个侧面上（图3A）。
<img src="/files/ftp_upload/3129/3129fig1.jpg" alt="用于胚胎孵育的灌注系统示意图，包含温度控制和气体混合物流动。" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图1"> 图1. 延时组织培养装置示意图。
<img src="/files/ftp_upload/3129/3129fig2.jpg" alt="胚胎发育示意图；矢量场，中线，头褶，延时轮廓分析。" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图 2"> 图 2. 利用追踪的荧光标记定量早期鸡胚中的二维组织形变。(A) 去除铁颗粒后 HH 5 期胚胎的明场/荧光叠加图像。DiI 标记的外胚层细胞（红色）分布于整个胚胎。(B,C) 使用 ImageJ 追踪标记细胞的运动。在胚胎坐标系（X,Y）中计算标记物的位移。注意，A 和 B 为同一图像。(D-F) 头褶形成过程中纵向应变分布的动态等高线图。相对于 HH 5 期（即 A 和 B）计算拉格朗日纵向应变，分别为孵育 (D) 75 分钟、(E) 120 分钟 和 (F) 165 分钟后的结果。这些应变描述了在 HH 5 期胚胎中原本沿 Y 轴方向的线元长度的变化。有关利用追踪标记坐标计算形态发生应变的更多细节，参见 Filas et al. (2007)6 和 Varner et al. (2010)7。注意，C 和 F 为同一图像。比例尺 = 500 μm。
<img src="/files/ftp_upload/3129/3129fig3.jpg" alt="细胞动态与形变；显微图像；带有应力图 Ezz、Eθθ 的示意图；数据分析。" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图 3"> 图 3. 量化早期鸡胚脑组织的三维形变。（A）黏附于脑管背侧（黑色箭头）和腹侧（白色箭头）的聚苯乙烯微球，在横截面中可清晰区别于周围组织。OCT 重建图像的腹侧视图显示了在（B）HH12 期和（C）培养 6 小时后，中脑-后脑边界附近的微球位置（M：中脑，H：后脑）。若干组微球被圈出，以突出显示组织的整体形变。（D）根据这些形变计算出的纵向（Ezz）和周向（Eθθ）拉格朗日应变。中脑-后脑边界处的正向纵向应变和负向周向应变反映了该区域在培养过程中发生轴向伸长和周向缩短。有关在形态发生过程中对复杂表面形态发生应变的计算更多细节，可参见 Filas et al. (2008)9。比例尺 = 200 μm。

<ol><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).</li>
<li>Canfield, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dry+beveling+micropipettes+using+a+computer+hard+drive%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Dry beveling micropipettes using a computer hard drive.</a> J. Neurosci. Methods. 158, 19-21 (2006).</li>
<li>Voronov, D. A., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+looping+in+experimental+conditions%3A+the+effects+of+extraembryonic+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Cardiac looping in experimental conditions: the effects of extraembryonic forces.</a> Developmental Dynamics. 224, 413-421 (2002).</li>
<li>Filas, B. A., Bayly, P. V., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stress+as+a+regulator+of+cytoskeletal+contractility+and+nuclear+shape+in+embryonic+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Mechanical stress as a regulator of cytoskeletal contractility and nuclear shape in embryonic epithelia.</a> Ann. Biomed. Eng. 39, 443-454 (2011).</li>
<li>Kozel, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+fiber+formation%3A+a+dynamic+view+of+extracellular+matrix+assembly+using+timer+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Elastic fiber formation: a dynamic view of extracellular matrix assembly using timer reporters.</a> J. Cell. Physiol. 207, 87-96 (2006).</li>
<li>Filas, B. A., Efimov, I. R., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+coherence+tomography+as+a+tool+for+measuring+morphogenetic+deformation+of+the+looping+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec%22%5BJournal%5D)">Optical coherence tomography as a tool for measuring morphogenetic deformation of the looping heart.</a> Anat. Rec. 290, 1057-1068 (2007).</li>
<li>Varner, V. D., Voronov, D. A., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+head+fold+formation%3A+investigating+tissue-level+forces+during+early+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mechanics of head fold formation: investigating tissue-level forces during early development.</a> Development. 137, 3801-3811 (2010).</li>
<li>Van Essen, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+software+suite+for+surface-based+analyses+of+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Med.+Inform.+Assoc%22%5BJournal%5D)">An integrated software suite for surface-based analyses of cerebral cortex.</a> J. Am. Med. Inform. Assoc. 8, 443-459 (2001).</li>
<li>Filas, B. A., Knutsen, A. K., Bayly, P. V., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+measuring+deformation+of+folding+surfaces+during+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech.+Eng%22%5BJournal%5D)">A new method for measuring deformation of folding surfaces during morphogenesis.</a> J. Biomech. Eng. 130, 061010-061010 (2008).</li>
<li>Yuan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-registered+optical+coherence+tomography+and+fluorescence+molecular+imaging+for+simultaneous+morphological+and+molecular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Co-registered optical coherence tomography and fluorescence molecular imaging for simultaneous morphological and molecular imaging.</a> Phys. Med. Biol. 55, 191-206 (2010).</li>
<li>Zamir, E. A., Czirok, A., Rongish, B. J., Little, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+digital+image-based+method+for+computational+tissue+fate+mapping+during+early+avian+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">A digital image-based method for computational tissue fate mapping during early avian morphogenesis.</a> Ann. Biomed. Eng. 33, 854-865 (2005).</li>
<li>Blanchard, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+tectonics%3A+morphogenetic+strain+rates%2C+cell+shape+change+and+intercalation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Tissue tectonics: morphogenetic strain rates, cell shape change and intercalation.</a> Nat. Methods. 6, 458-464 (2009).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

两种组织标记技术被用于 体外孵化 早期鸡胚的培养。第一种方法利用磁性铁颗粒递送荧光脂溶性染料，可同时标记数百个细胞。然而，该方法目前与光学相干断层扫描（OCT）不兼容，因为荧光染料在OCT中通常与周围组织的对比度较低10因此，我们展示了一种使用聚苯乙烯微球标记组织以进行活体 OCT 时间序列分析的替代技术。该技术可生成三维数据集，但必须注意避免微球从组织上脱落。在适当的实验条件下采用这两种方法中的任何一种，均可实现可靠的组织标记。 体外孵化 早期胚胎发育。这两种方法均使用易于获取且相对低成本的材料（如铁粉、聚苯乙烯微球），可在形态发生过程中实现组织形变的定量分析。在这两种情况下，组织标记物均可被简便且可重复地应用于胚胎组织，且无需特殊设备，从而使该实验技术易于被领域内的新手所掌握。对所得数据进行可视化与分析（例如通过计算形态发生应变图）将有助于揭示您的模型系统中形态发生的力学机制。6, 7, 9, 11, 12.

<table><tbody><tr><td>DMEM &amp;mdash; 高糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素/新霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4083</td><td></td></tr><tr><td>鸡血清</td><td>Invitrogen</td><td>16110-082</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1408</td><td>10X</td></tr><tr><td>Whatman #2 滤纸</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>1002 090</td><td>直径 90mm</td></tr><tr><td>玻璃微量移液管</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW150-6</td><td>内径 1.5mm</td></tr><tr><td>DiI</td><td>Invitrogen</td><td>D-282</td><td></td></tr><tr><td>低铁</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>5320</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;mu;m 直径微球（黑色）</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>24294</td><td></td></tr><tr><td>Delta T 培养皿（用于延时培养）</td><td>Bioptechs</td><td>04200415B</td><td>厚度 0.17mm，黑色</td></tr><tr><td>Delta T4 培养皿控制器</td><td>Bioptechs</td><td>0420-4-03</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Pump 可调流速装置</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

追踪早期鸡胚中的形态发生组织形变

Tracking Morphogenetic Tissue Deformations in the Early Chick Embryo 

胚胎上皮会经历复杂的形变（例如弯曲、扭转、折叠和拉伸），以形成早期胚胎的原始器官。在这些细胞层表面追踪标记点是估算形态发生量（如生长、收缩和剪切）的成熟方法。然而，并非所有表面标记技术都易于适配常规成像方式，且各自具有不同的优势与局限性。本文中，我们描述了两种标记方法，并展示了每种技术的应用价值。第一种方法利用磁性铁颗粒，同时在胚胎上施加数百个荧光标记，进而用于量化形态发生过程中的二维组织形变。第二种方法则使用聚苯乙烯微球作为非侵入性光学相干断层扫描（OCT）成像中的对比剂，以追踪三维组织形变。这些技术已在本实验室成功应用于研究早期头褶、心脏和大脑发育的物理机制，且应可广泛适用于多种形态发生过程。

本文介绍了早期鸡胚的表面标记及ex ovo组织培养技术。文中展示了适用于延时明场、荧光和光学相干断层扫描成像的技术方法。通过高时空分辨率追踪表面标记，能够在二维和三维条件下计算形态发生应变（形变）等运动学参数。

胚胎上皮经历复杂的形变（如弯曲、扭转、折叠和拉伸），以形成早期胚胎的原始器官。

本文所介绍技术的总体目标是对胚胎组织进行标记和培养，以测量早期发育过程中的形态发生形变。对于早期鸡胚的培养，首先使用滤纸载体法从蛋中取出胚胎。根据实验应用的不同，可通过磁性铁颗粒携带的荧光脂溶性染料或聚苯乙烯微球对标记提取的胚胎进行标记。随后，在培养过程中利用荧光显微镜或光学相干断层扫描成像技术追踪这些标记。成像所获得的形态发生应变图揭示了组织在二维和三维空间中的伸长、缩短和剪切区域。大家好，我叫 Ben Philis，是圣路易斯华盛顿大学生物医学工程系 Larry Tabor 博士实验室的一名研究生。在开始此类实验之前，重要的是要考虑您的模型系统中相关的组织培养技术、您可使用的成像方式，以及您希望从实验中获取的数据类型。例如，您是否对在二维或三维条件下分析组织形变感兴趣？今天，我们将通过展示早期鸡胚中的两种互补标记技术来探讨上述部分问题。大家好，我叫 Victor Varner，我在圣路易斯华盛顿大学 Larry Tabor 博士的实验室工作。在这两种技术中，我们能够快速且同时标记早期鸡胚中的数百个细胞。通过追踪这些标记的运动，不仅可以确定这些细胞最终迁移到哪些组织，还可以量化塑造早期胚胎的组织水平形变。首先，将鸡蛋按汉堡氏和汉密尔顿定义的发育阶段，以纵向方向进行孵化培养。将鸡蛋底部轻敲于直径150毫米的培养皿边缘，使蛋壳破裂。从底部将蛋壳掰开，将蛋液倒入培养皿中，并使用钝头镊子去除蛋黄周围较厚的黏稠状蛋清。接着，在圆形滤纸的中央打孔。将一张滤纸环置于卵黄上，使胚胎可通过滤纸环的中央孔洞可见。用显微剪刀沿滤纸环外周进行修剪。然后用精细镊子将带有胚胎的滤纸从卵黄上取下，并轻轻将其浸入 PBS 溶液中。为去除附着的卵黄颗粒，将滤纸组件转移至一个 35 毫米的培养皿中。将胚胎腹侧朝上放置，用第二个滤纸环支撑胚胎。用金属环固定，并将胚胎完全浸入培养液中。如果胚胎未完全浸没，异常增高的表面张力负荷会显著改变组织几何形态及后续的形态发生过程。培养过程中，使用明场显微镜检查细胞形态和胚胎发育阶段是否正常。首先取少量铁粉，加入几滴饱和染料和酒精，用拉制的微量移液管尖端进行风干。将结块的铁颗粒打散后转移至微量离心管中。用去离子水冲洗数次后，将收获的胚胎背侧朝上置于一个35毫米的培养皿中，并覆盖一层充足的培养基。在解剖显微镜下，用玻璃针去除卵黄膜，暴露外胚层细胞。现在将一柱标记的铁颗粒吸入微量移液器中。使用解剖显微镜，将移液管浸入并定位在胚胎上方。用手指轻轻前后缓慢滚动移液管，使颗粒均匀撒在胚胎表面。在37摄氏度孵育10分钟后，使用强磁铁去除颗粒。如有必要，将磁铁附着在一对精细镊子上，使用磁化镊子小心去除残留的铁颗粒。随后获取胚胎的明场和荧光图像。使用22号针头。将PBS中的黑色10微米直径微球溶液吸入一支10 cc注射器中。然后使用计算机硬盘对拉制的玻璃针尖进行斜面处理，并用微球溶液填充。使用显微操作器轻轻弹击微量移液管，使溶液流至尖端。将玻璃针置于与胚胎相同的视野中。确认珠子从移液管尖端流出。现在将移液管尖端插入脑管腔内。注意不要刺穿组织的腹侧基底。当珠子和液体进入管腔时，观察组织出现的短暂肿胀。然后迅速移除玻璃针。最后，验证脑管内腔具有足够的微珠密度。使用明场显微镜观察，让微珠沉降20至30分钟，然后采集明场图像或光学相干断层扫描数据集。采集首组图像后，将最多7个35毫米的培养皿样品放入一个150毫米的培养皿中，并将整个装置置于一个小塑料袋内。加入去离子水数滴以湿润袋子，然后用95%氧气和5%二氧化碳的混合气体填充袋子。将胚胎置于37°C培养箱中，直至下一个成像时间点。将已标记的胚胎放入含有1.2毫升培养液的Delta T培养皿中，并用玻璃盖盖住培养皿，保持在37°C。通过微型泵可调流速装置提供的95% O₂、5% CO₂混合气体对胚胎进行超灌注。现在设置软件，以自动在所需的时间间隔采集图像。在实验过程中，可自动或手动追踪标记，并可根据标记坐标计算形态发生应变图。本研究采用铁颗粒技术标记并追踪头褶形成过程中表皮细胞的运动。在早期鸡胚中，荧光标记的细胞分布于整个胚胎。在体外培养期间的不同时间点，采集了胚胎的明场和荧光图像，以监测管道标记物的运动。累积数据可用于计算头褶形成过程中不断变化的形态发生应变分布。类似地，聚苯乙烯微球技术被用于追踪早期鸡胚脑部中后脑边界的组织运动。需要注意的是，该方法能够处理明显的三维形变，因为微球倾向于附着在脑内腔各个侧面上。在追踪微球运动六小时后，通过标记物坐标可计算应变，从而表征组织在纵向和周向方向上的形变情况。观看本视频后，您应能较好地了解实施自身组织培养与标记所需的一些实验步骤。此处介绍的实验方案技术具有显著优势：对天然组织的侵入性极小，且所需材料成本低廉、易于获取。这些实验特别适用于胚胎发育力学相关研究。由于利用标记细胞的追踪运动所计算出的形变场可用于检验和构建形态发生过程的物理模型。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

在早期鸡胚跟踪形态组织变形

本文介绍了一种组织移植技术，旨在测试颅面发育过程中头部表面外胚层的信号传导和模式形成特性。...

评估颅面发育过程中外胚层上皮的信号特性

在发育过程中观察和接触鸡胚具有一定的挑战性。我们开发了一种简单、经济的体外培养（ex ovo）方法，可广泛应用于课堂教学或科研环境。该方法能够使研究者在胚胎发育的较晚阶段（HH...

优化的 体外培养 培养鸡胚胎至发育的较晚阶段

通过将浸泡过生长因子或特定信号通路抑制剂的微珠移植到发育中的胚胎中，可直接检测这些因子的作用效果...

将微珠移植至鸡胚肢体发育区域以鉴定影响基因表达的信号转导通路

本文描述了在鸡胚中利用不可渗透屏障阻断主轴体与 flank...

应用不可渗透屏障结合候选因子浸泡微珠研究鸡胚中的诱导信号

在此，我们介绍一种引入新方法集的实验方案 体外培养...

探究物理力在早期鸡胚形态发生中的作用

本方案旨在对细胞取向和组织生长动态进行成像与分析 果蝇 果蝇在变态过程中腹部上皮的变化。本文所述方法可应用于研究不同发育阶段、组织及亚细胞结构 黑腹果蝇...

成像与分析发育过程中组织方向性与生长动态 黑腹果蝇 蛹期上皮组织

本文介绍了一种设计用于检测基底前脑信号传导与模式形成特性的组织移植技术。 在颅面发育过程中。...

创建禽类前脑嵌合体以评估面部发育

重组肢体是一种强大的实验模型，可用于研究在胚胎信号影响下细胞分化及模式形成的过程。本方案介绍了一种利用鸡肢芽中胚层细胞生成重组肢体的详细方法，该方法可适用于从不同生物体获得的其他细胞类型。...

鸡胚胎重组肢体实验：解析形态发生、模式形成及细胞分化早期过程

浸泡珠实验涉及在发育的任意时间点将测试试剂靶向递送，以研究细胞分化和形态发生的调控。本文提供了一种详细的实验方案，适用于任何实验动物模型，介绍如何制备三种不同类型的浸泡珠，并将其植入鸡胚的趾间区域。...

利用浸润珠实验分析鸡胚胎发生过程中的细胞分化、形态发生与图式形成

本文介绍了三种禽类胚胎皮肤外植体培养的实验方案，可用于研究组织间的相互作用、4D成像延时电影（三维加时间）、分子功能的全局或局部干扰，以及系统生物学表征。...

利用禽类皮肤外植体研究组织模式形成与器官发生

本方案旨在对鸡胚神经管形成过程中神经板组织的力学特性进行纵向监测。该方法结合了布里渊显微镜与载物台式培养系统，可实现神经板组织在活体状态下的力学成像 体外孵化...

监测鸡胚神经管闭合过程中组织的力学演变

了解早期鸡胚形态组织变形的高分辨率追踪技术，学习使用荧光脂溶性染料或聚苯乙烯微球进行表面标记，结合荧光显微镜和光学相干断层扫描成像，实时分析组织伸长、缩短和剪切应变。

追踪早期鸡胚中的形态发生组织形变

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