追踪早期鸡胚中的形态发生组织形变

本文所介绍技术的总体目标是对胚胎组织进行标记和培养，以测量早期发育过程中的形态发生形变。对于早期鸡胚的培养，首先使用滤纸载体法从蛋中取出胚胎。根据实验应用的不同，可通过磁性铁颗粒携带的荧光脂溶性染料或聚苯乙烯微球对标记提取的胚胎进行标记。随后，在培养过程中利用荧光显微镜或光学相干断层扫描成像技术追踪这些标记。

成像所获得的形态发生应变图揭示了组织在二维和三维空间中的伸长、缩短和剪切区域。大家好，我叫 Ben Philis，是圣路易斯华盛顿大学生物医学工程系 Larry Tabor 博士实验室的一名研究生。在开始此类实验之前，重要的是要考虑您的模型系统中相关的组织培养技术、您可使用的成像方式，以及您希望从实验中获取的数据类型。

例如，您是否对在二维或三维条件下分析组织形变感兴趣？今天，我们将通过展示早期鸡胚中的两种互补标记技术来探讨上述部分问题。大家好，我叫 Victor Varner，我在圣路易斯华盛顿大学 Larry Tabor 博士的实验室工作。

在这两种技术中，我们能够快速且同时标记早期鸡胚中的数百个细胞。通过追踪这些标记的运动，不仅可以确定这些细胞最终迁移到哪些组织，还可以量化塑造早期胚胎的组织水平形变。首先，将鸡蛋按汉堡氏和汉密尔顿定义的发育阶段，以纵向方向进行孵化培养。

将鸡蛋底部轻敲于直径150毫米的培养皿边缘，使蛋壳破裂。从底部将蛋壳掰开，将蛋液倒入培养皿中，并使用钝头镊子去除蛋黄周围较厚的黏稠状蛋清。接着，在圆形滤纸的中央打孔。

将一张滤纸环置于卵黄上，使胚胎可通过滤纸环的中央孔洞可见。用显微剪刀沿滤纸环外周进行修剪。然后用精细镊子将带有胚胎的滤纸从卵黄上取下，并轻轻将其浸入 PBS 溶液中。为去除附着的卵黄颗粒，将滤纸组件转移至一个 35 毫米的培养皿中。

将胚胎腹侧朝上放置，用第二个滤纸环支撑胚胎。用金属环固定，并将胚胎完全浸入培养液中。如果胚胎未完全浸没，异常增高的表面张力负荷会显著改变组织几何形态及后续的形态发生过程。

培养过程中，使用明场显微镜检查细胞形态和胚胎发育阶段是否正常。首先取少量铁粉，加入几滴饱和染料和酒精，用拉制的微量移液管尖端进行风干。将结块的铁颗粒打散后转移至微量离心管中。

用去离子水冲洗数次后，将收获的胚胎背侧朝上置于一个35毫米的培养皿中，并覆盖一层充足的培养基。在解剖显微镜下，用玻璃针去除卵黄膜，暴露外胚层细胞。现在将一柱标记的铁颗粒吸入微量移液器中。

使用解剖显微镜，将移液管浸入并定位在胚胎上方。用手指轻轻前后缓慢滚动移液管，使颗粒均匀撒在胚胎表面。在37摄氏度孵育10分钟后，使用强磁铁去除颗粒。

如有必要，将磁铁附着在一对精细镊子上，使用磁化镊子小心去除残留的铁颗粒。随后获取胚胎的明场和荧光图像。使用22号针头。

将PBS中的黑色10微米直径微球溶液吸入一支10 cc注射器中。然后使用计算机硬盘对拉制的玻璃针尖进行斜面处理，并用微球溶液填充。使用显微操作器轻轻弹击微量移液管，使溶液流至尖端。

将玻璃针置于与胚胎相同的视野中。确认珠子从移液管尖端流出。现在将移液管尖端插入脑管腔内。

注意不要刺穿组织的腹侧基底。当珠子和液体进入管腔时，观察组织出现的短暂肿胀。然后迅速移除玻璃针。

最后，验证脑管内腔具有足够的微珠密度。使用明场显微镜观察，让微珠沉降20至30分钟，然后采集明场图像或光学相干断层扫描数据集。采集首组图像后，将最多7个35毫米的培养皿样品放入一个150毫米的培养皿中，并将整个装置置于一个小塑料袋内。

加入去离子水数滴以湿润袋子，然后用95%氧气和5%二氧化碳的混合气体填充袋子。将胚胎置于37°C培养箱中，直至下一个成像时间点。将已标记的胚胎放入含有1.2毫升培养液的Delta T培养皿中，并用玻璃盖盖住培养皿，保持在37°C。通过微型泵可调流速装置提供的95% O₂、5% CO₂混合气体对胚胎进行超灌注。现在设置软件，以自动在所需的时间间隔采集图像。

在实验过程中，可自动或手动追踪标记，并可根据标记坐标计算形态发生应变图。本研究采用铁颗粒技术标记并追踪头褶形成过程中表皮细胞的运动。在早期鸡胚中，荧光标记的细胞分布于整个胚胎。

在体外培养期间的不同时间点，采集了胚胎的明场和荧光图像，以监测管道标记物的运动。累积数据可用于计算头褶形成过程中不断变化的形态发生应变分布。

类似地，聚苯乙烯微球技术被用于追踪早期鸡胚脑部中后脑边界的组织运动。需要注意的是，该方法能够处理明显的三维形变，因为微球倾向于附着在脑内腔各个侧面上。在追踪微球运动六小时后，通过标记物坐标可计算应变，从而表征组织在纵向和周向方向上的形变情况。

观看本视频后，您应能较好地了解实施自身组织培养与标记所需的一些实验步骤。此处介绍的实验方案技术具有显著优势：对天然组织的侵入性极小，且所需材料成本低廉、易于获取。这些实验特别适用于胚胎发育力学相关研究。

由于利用标记细胞的追踪运动所计算出的形变场可用于检验和构建形态发生过程的物理模型。