星形胶质细胞培养物中细胞表面蛋白与胞内蛋白的分离

取星形胶质细胞培养物，移除培养基，加入生理缓冲液，置于冰上孵育，以抑制细胞表面蛋白的内吞作用。

使用可结合细胞表面蛋白的生物素化试剂进行孵育。

接着，用淬灭缓冲液孵育，以灭活任何未反应的试剂。

加入冰冷的生理缓冲液并机械吹打使细胞脱离。转移细胞后，离心并弃去上清液。

加入裂解缓冲液孵育，使细胞裂解，释放生物素标记的细胞表面蛋白和非生物素标记的细胞内蛋白。

离心，收集上清液，并分离出含有总蛋白的组分。

将剩余组分与包被链霉亲和素的磁珠在振荡条件下孵育，以结合生物素标记的蛋白质。

离心收集结合有细胞表面蛋白的磁珠，并分离含有胞内蛋白的上清液。

在振荡条件下洗涤磁珠，以去除非特异性结合的蛋白质，然后离心并弃去上清液，从而分离细胞表面蛋白质。

含有总蛋白、细胞内蛋白和细胞表面蛋白的组分已准备好进行分析。

开始此操作时，从培养箱中取出星形胶质细胞培养物，并通过抽吸弃去培养基。用4毫升预冷的CM-PBS洗涤细胞三次，并将培养皿置于碎冰上。

吸去 CM-PBS，然后每孔加入 2 毫升生物素缓冲液。轻轻前后倾斜培养皿数次，以确保溶液完全覆盖，再将培养物置于冰上孵育 30 分钟。

随后，移除生物素缓冲液，加入四毫升淬灭缓冲液，将培养物置于冰上静置10分钟。接着，吸除并更换等量的淬灭缓冲液，再次将培养物置于冰上静置10分钟。

然后，弃去淬灭缓冲液，用 4 毫升预冷的 CM-PBS 洗涤细胞三次。接着，将细胞刮入 1 毫升预冷的 CM-PBS 中，并将悬液转移至微量离心管中。

接下来，在4摄氏度的预冷微量离心机中，以100 g 离心3分钟，使细胞沉淀。然后弃去上清液，并将细胞重悬于500微升裂解缓冲液中。

然后将样品置于冰上孵育30分钟，每5分钟涡旋振荡一次。随后，在4°C条件下以14,000 g 离心10分钟，使去污剂和可溶性物质沉淀。接着，将上清液转移至新的微量离心管中。保留50微升裂解液，并加入25微升3×上样缓冲液。

随后，在干浴器中于 95 摄氏度加热使其变性。此为输入组分，包含生物素标记的细胞表面蛋白以及非生物素化的胞质蛋白。使用剪去末端的移液枪头，将 75 微升链霉亲和素琼脂糖磁珠转移至裂解液中，在 4 摄氏度下于摇床上孵育三小时。

随后，在 4 摄氏度下以 1,500 g 离心 30 秒，使链霉亲和素琼脂糖珠沉淀。保留 50 微升上清液，并加入 25 微升 3× 上样缓冲液。然后在 95 摄氏度的水浴或加热块中使其变性。此样品代表细胞内组分，主要由非生物素化的胞质蛋白组成。

随后，将沉淀的珠子重悬于1毫升洗涤缓冲液中，在4摄氏度下振摇3分钟。离心收集珠子，并弃去上清液。重复此步骤四次，以最大限度减少非生物素化胞质蛋白的非特异性结合。

加入50 µL用裂解缓冲液稀释至1×的上样缓冲液。在95°C下变性，使生物素和链霉亲和素从磁珠上释放。该组分应仅包含生物素化的细胞表面蛋白。