Name: 一个用于标识Allelotyping PCR扩增沙门氏菌肠炎血清型，哈达尔，海德堡和鼠伤寒沙门氏菌 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: 学习多重PCR等位基因分型技术快速鉴定沙门氏菌肠炎、哈达尔、海德堡和鼠伤寒血清型。该方法通过O抗原和鞭毛蛋白基因检测，为食品安全监测和流行病学研究提供快速可靠的诊断工具。

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本工作得到了美国农业部资助项目（编号：1999-35212-8680、2005-01378 和 2010-04288-01）、美国农业部配方基金以及佐治亚州兽医医学农业研究基金的支持。本文所描述的实验方案最初为本科生指导性研究课程而设计，包括佐治亚大学的 MIBO 4900L、GENE 4960H、BCMB 4960L 和 BIOL 4960H 课程，并已在 Maurer 实验室的多项分子流行病学研究项目中由学生实际应用。我们谨向在 Maurer 和 Lee 实验室中从事研究工作的众多本科生，以及支持我们将本科教学与科研相融合工作的本系主任 John Glisson 表示感谢。

<ol><li>Dauga, C., Zabrovskaia, A., Grimont, P. A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restriction+fragment+length+polymorphism+analysis+of+some+flagellin+genes+of+Salmonella+enterica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Restriction fragment length polymorphism analysis of some flagellin genes of Salmonella enterica.</a> J. Clin. Microbiol. 36, 2835-2843 Forthcoming.</li>
<li>Hong, Y., Liu, T., Lee, M. D., Hofacre, C. L., Maier, M., White, D. G., Ayers, S., Wang, L., Berghaus, R., Maurer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+screen+of+broth+enrichments+for+Salmonella+enterica+serovars+Enteritidis%2C+Hadar%2C+Heidelberg%2C+and+Typhimurium+using+an+allelotyping+multiplex+PCR+that+targets+O+and+H+antigen+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Food+Prot%22%5BJournal%5D)">A rapid screen of broth enrichments for Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium using an allelotyping multiplex PCR that targets O and H antigen alleles.</a> J. Food Prot. 72, 2198-2201 (2009).</li>
<li>Hong, Y., Liu, T., Lee, H. ofacre, Maier, C. L., White, M., Ayers, D. G., Wang, S., Berghaus, L., R, M. aurer <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((J.Rapid+screening+of+Salmonella+enterica+serovars+Enteritidis%2C+Hadar%2C+Heidelberg+and+Typhimurium+using+a+serologically-correlative+allelotyping+PCR+targeting+the+O+and+H+antigen+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">J.Rapid screening of Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg and Typhimurium using a serologically-correlative allelotyping PCR targeting the O and H antigen alleles.</a> BMC Microbiol. , (2008).</li>
<li>Liu, T., Liljebjelke, K., Bartlett, E., Hofacre, C. L., Sanchez, S., Maurer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+nested+PCR+to+detection+of+Salmonella+in+poultry+environments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Food+Prot%22%5BJournal%5D)">Application of nested PCR to detection of Salmonella in poultry environments.</a> J. Food Prot. 65, 1227-1232 (2002).</li>
<li>Maurer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+and+limitation+of+molecular+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Food+Sci.+Tech%22%5BJournal%5D)">Rapid detection and limitation of molecular techniques.</a> Ann. Rev. Food Sci. Tech. 2, 259-279 (2011).</li>
<li>Moscoso, H., Alvarado, I., Hofacre, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+infectious+bursal+disease+virus+from+bursal+tissues+collected+on+FTA+filter+paper%5BTitle%5D)+AND+%22Avian+Dis%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of infectious bursal disease virus from bursal tissues collected on FTA filter paper.</a> Avian Dis. 50, 391-396 (2006).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory%22">Molecular cloning: a laboratory</a>. , 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (1989).</li>
<li>Wittwer, C. T., Fillmore, G. C., Hillyard, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+polymerase+chain+reaction+capillary+tubes+with+hot+air%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Automated polymerase chain reaction capillary tubes with hot air.</a> Nucleic Acids Res. 17, 4353-4357 (1989).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

大多数市售的用于检测的PCR检测方法 沙门氏菌 特异性靶向该属独有的基因（例如 invA）。然而，并非所有 沙门氏菌 在人类致病能力或动物群体中的流行率方面并无差异。抗原差异的早期识别在 沙门氏菌 LPS O-抗原以及鞭毛素H1和H2抗原已导致了分化 沙门氏菌 根据这些抗原差异，可分为超过2,500种血清型。该属中已鉴定出46种不同的O抗原和86种不同的鞭毛蛋白（H）抗原。 沙门氏菌. 沙门氏菌 可能具有一条（H1）或两条不同的（H1&amp;H2）鞭毛蛋白。不同的O、H1和H2抗原组合构成了2,500种血清型 沙门氏菌 目前公认的血清型。血清型的指定基于通过鉴定个体O抗原和H抗原得出的抗原式。抗原式写作O:H1:H2；其中“-”表示H1或H2鞭毛蛋白缺失，“NT”（不可分型）表示无法定型 沙门氏菌 O抗原阴性。例如，伤寒沙门菌血清型被归入一个 S. enterica 分离株的抗原公式为 B: i: 1,2，而具有 D1: g,m: - 公式的分离株则归为肠炎沙门菌。这种抗原变异在 沙门氏菌 种群的差异在核苷酸水平上表现明显，因此可通过PCR技术轻松加以利用。 
我们已鉴定出与特定O和H等位基因相关的遗传差异，从而开发了一种等位基因分型PCR，用于鉴定S. enterica的血清型：Enteritidis、Hadar、Heidelberg和Typhimurium（3）。准确判定和报告Salmonella血清型，需要检测与Enteritidis（D1: g,m: -）、Hadar（C2: z10: e,n,x）、Heidelberg（B: r: 1,2）和Typhimurium（B: i: 1,2）对应的O: H1: H2抗原组合所关联的所有等位基因。若不了解O等位基因或抗原类型，仅发现H1 g,m等位基因并不能确定该Salmonella分离株即为Enteritidis，因为其他Salmonella血清型如Agona、California和Montevideo也具有相同的等位基因。尽管该等位基因分型PCR最初设计用于检测上述提及的Salmonella血清型，但该检测还可识别另外19种血清型（表3）。我们的等位基因分型PCR最初旨在检测O和H等位基因。在实际操作中，对于分离的Salmonella培养物，使用O特异性抗血清进行玻片凝集试验来鉴定O抗原，比进行O等位基因分型PCR更为实用且成本更低。然而，如果您的实验室将O等位基因分型PCR用作筛查手段（2），或用于鉴定提交在FTA卡片上的Salmonella分离株（6），我们建议使用该方法，并在样本初筛时同时包含Salmonella特异性PCR（4）。应将等位基因分型PCR限定于那些已通过PCR或生化/抗原检测确认为Salmonella的样本。
本文所述方案已针对Idaho Technology Rapidcycler进行优化，该仪器为热空气热循环仪，可减少反应体积，并且运行反应条件所需时间少于许多加热块式热循环仪。若将本方案适配至加热块式热循环仪，可能需要通过降低或提高退火温度、调整引物浓度或调整MgCl2浓度等方式，对反应条件进行经验性优化。例如，我们已将本方案适配至MJ Research PTC-200热循环仪，具体如下：采用表1中所述相同反应体积，i引物组的工作储备浓度稀释至2.5 μM，退火温度从55°C降至45°C，且在i/g、m等位分型PCR的变性、退火和延伸步骤中，孵育时间均延长至20秒。在任何PCR（包括已发表的方案）的初始启动和优化过程中，设置适当的阳性和阴性对照至关重要。我们建议获取已知的Salmonella血清型作为阳性对照，具体包括Anatum（E1: e,h: 1,6）、Enteritidis（D1: g,m: -）、Hadar（C2: z10: e,n,x）、Heidelberg（B: r: 1,2）、Montevideo（C1: g,m,s: 1,2,7）和Typhimurium（B: i: 1,2）；同时建议采用实验室常用的Escherichia coli K12菌株（如DH5α、LE393、JM109等）作为阴性对照，用于本文所述的等位分型PCR检测。这些Salmonella血清型中，部分将根据所检测的等位基因不同，分别作为阳性或阴性对照使用。
进行本实验及其他任何诊断性PCR时，需遵循特定的预防措施和指导原则。首先，模板制备、PCR反应体系构建以及凝胶电泳操作区域的物理分离至关重要，可有效防止PCR产物残留污染，避免假阳性结果的错误报告。此外，任何常规PCR实验中均需设置适当的对照，因为这些对照能够及时发现实验过程中出现的问题，并有助于结果的准确解读（5）。尤为重要的是实验条件的一致性，特别是扩增产物（PCR产物）检测及扩增片段大小估计所用的电泳条件。为说明这一点，图1A中我们有意提前终止了电泳过程。此时，分子量标准（第1和第13泳道）及阳性对照（第2泳道）的条带未能充分分离，无法准确估计片段大小，也无法清晰分辨DNA片段间较小的长度差异。&tilde;50 bp）的大小。DNA片段（尤其是分子量标准）的充分分离至关重要，因为阳性结果的判定依赖于扩增片段大小的准确估算，并且需要区分“真阳性”与日常PCR运行中偶尔出现的非特异性扩增产物（5）。例如，在图1B第7泳道中存在一个非特异性扩增产物&tilde;大小为700 bp）。如果电泳过早停止，当染料前沿仅迁移至琼脂糖凝胶的中点时，500 bp与700 bp的DNA片段之间将几乎没有区分开来。因此，第7泳道的样本将被错误地判读为同时含有i和g,m等位基因阳性。 
最后，需要认识到任何检测方法都存在一定的局限性。部分H1/H2等位基因分型PCR无法有效区分属于H2 1,2；1,5；1,6；1,7抗原复合体、e,n,x/e,n,z15抗原复合体以及包含g,m等位基因的H1 G抗原复合体等位基因之间的细微遗传差异。这些鞭毛抗原中存在的不同表位通常仅由一至两个氨基酸的差异决定。因此，我们难以设计出能够有效利用鞭毛蛋白基因序列中有时仅为单个碱基对差异的引物（3）。例如， 沙门氏菌 血清型都柏林（D1: g,p: -）和贝尔塔（D1: f,g,t: -）使用我们的g,m等位分型引物也会产生PCR阳性结果。H2等位分型引物无法区分伤寒沙门菌（B: i : 1,2）与拉各斯（B: i: 1,5）、海德堡（B: r: 1,2）与布拉德福德（B: r: 1,5）、温尼巴（B: r: 1,6）或雷莫（B: r: 1,7），也无法区分哈达尔（C2: z10: e,n,x）与格洛斯特鲁普（C2: z10: e,n,z15）。尽管遇到拉各斯、布拉德福德、温尼巴、雷莫或格洛斯特鲁普等血清型的概率极低，但仍存在可能性，因此需在检测报告中注明该检测方法的局限性，或进行其他确证性检测。 
综上所述，这种基于 PCR 的血清型分型方法可快速鉴定 S. enterica 血清型 Enteritidis、Hadar、Heidelberg 和 Typhimurium，以及与另外 19 种血清型相关的 O、H1 和 H2 等位基因。该检测方法是一种快速、经济高效的替代方案，可用于取代传统微生物学方法对 Salmonella 进行血清型分型。

<table><tbody><tr><td>LB培养基（Luria Bertani）</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>（或任何可比来源）</td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>1.5 ml 容量</td><td>（或任何可比来源）</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>200 proof</td><td>（或任何可比来源）</td></tr><tr><td>dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>分子生物学级</td><td>（或任何可比来源；仅用于PCR）</td></tr><tr><td>10 x PCR缓冲液：</td><td>Idaho Technologies</td><td>20 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>（缓冲液含BSA、Ficoll和酒石黄）</td></tr><tr><td></td><td></td><td>30 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>40 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td></tr><tr><td>PCR引物</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Roche Group</td><td></td><td>（或任何可比来源）</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Taq&lt;/em&gt; DNA聚合酶</td><td>Denville Scientific</td><td></td><td>（或任何可比来源）</td></tr><tr><td>毛细吸管</td><td>Idaho Technologies</td><td>10 &amp;#181;l 体积</td><td></td></tr><tr><td>快速PCR仪</td><td>Idaho Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Bio-Rad</td><td>低电渗；分子生物学级</td><td>（或任何可比来源）</td></tr><tr><td>50 X TAE缓冲液或5X TBE缓冲液</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>（或任何可比来源）</td></tr><tr><td>溴化乙锭</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>（或任何可比来源）</td></tr><tr><td>带凝胶模具的水平浸没式凝胶电泳槽</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>（或任何可比来源）</td></tr><tr><td>电源</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>（或任何可比来源）</td></tr><tr><td>分子成像凝胶成像系统（Molecular Imager Gel Doc System）</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>（或任何可比来源）</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表4. 材料&lt;/strong&gt;</td></tr></tbody></table>

一种用于鉴定的等位基因分型pcr 鼠伤寒沙门氏菌 血清型肠炎沙门菌、哈达尔沙门菌、海德堡沙门菌和鼠伤寒沙门菌

An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

目前商业化的PCR检测通过靶向该属特有的基因来鉴定Salmonella。然而，Salmonella包含两个物种、六个亚种以及超过2500种不同的血清型，它们在公共卫生意义上的重要性并不相同。例如，在商品蛋鸡场检出S. enterica亚种IIIa亚型Arizona的公共卫生意义，远不及检出S. enterica亚种I血清型Enteritidis，后者是与食用商品鸡蛋相关的沙门菌病的主要病因。血清型的鉴定依据是脂多糖（LPS）（O抗原）和鞭毛蛋白（H1和H2抗原）的抗原差异。这些抗原差异正是与该表型相关的基因及其等位基因多样性的外在表现。
我们开发了一种基于四种主要类型之间遗传差异的等位基因分型多重PCR S. enterica 亚种I血清型，常见于家禽，并与美国严重的人类疾病相关。PCR引物对针对特定亚种独有的关键基因或序列 沙门氏菌 血清型，并设计为扩增出针对该基因或等位基因的特异性大小的扩增片段。 沙门氏菌 根据特定LPS和鞭毛蛋白基因等位基因的PCR检测结果组合，为分离株指定血清型。本文所述的多重PCR专门用于检测 S. enterica 血清型I亚种：肠炎沙门菌、哈达尔沙门菌、海德堡沙门菌和鼠伤寒沙门菌。
本文演示如何使用多重 PCR 鉴定沙门菌（Salmonella）分离株的血清型。

我们描述了一种多重PCR方法，用于快速检测肠道沙门菌（Salmonella enterica）的肠炎血清型（Enteritidis）、哈达尔血清型（Hadar）、海德堡血清型（Heidelberg）和鼠伤寒血清型（Typhimurium）。通过针对特定血清型O-抗原生物合成基因簇及鞭毛蛋白基因中独特基因和序列的多重PCR，可鉴定特定的沙门菌血清型。随后，根据出现的特异性扩增片段（PCR产物）大小，对应于目标等位基因，即可将血清型分配给相应的沙门菌分离株。

一种用于鉴定的等位基因分型PCR 鼠伤寒沙门氏菌 血清型肠炎沙门菌、哈达尔沙门菌、海德堡沙门菌和鼠伤寒沙门菌

目前商业化的PCR检测通过靶向沙门氏菌属特有的基因来鉴定沙门氏菌。然而，该属包含两个物种、六个亚种以及超过……

以下实验的总体目标是鉴定特定的沙门氏菌抗原等位基因。通过靶向PCR来识别与这些等位基因相关的特异性序列差异，从而实现该目标。将样品模板加入含有等位基因特异性引物以及OH1和H2等位基因分型的PCR反应体系中。在热循环仪中进行PCR反应。随后通过凝胶电泳按大小分离PCR产物，以确定每个样本或分离株中是否存在扩增片段，并分析其大小。然后将扩增片段的大小与PCR中所用各引物组的预期大小进行比对，从而获得结果，显示特定沙门氏菌抗原的鉴定。通过PCR检测等位基因，然后根据OH1和H2多重PCR检测结果确定血清型。本视频中所述方案相较于SYP的主要优势在于操作快速、结果易于解读且成本较低。该方法有助于回答流行病学领域的一些关键问题，例如确定沙门菌变异株在禽类或奶牛养殖场内部或之间的分布与持续存在情况。该技术的应用可扩展至由沙门菌（salmonella）、血清型（serovars）、阿里亚（arius）或尿源性（urian）引起的鲑鱼病的快速诊断。对该方法进行可视化展示，对于理解如何利用基于PCR的技术将沙门菌鉴定到血清型水平至关重要。本实验操作由佐治亚大学李·莫尔实验室的研究科学家Adriana Pedroso和Yin Chang进行演示。首先准备用于后续PCR反应的全细胞DNA模板。首先，用沙门氏菌接种一毫升 LB 肉汤，从单个菌落中分离。将培养物置于 37 摄氏度、200 至 250 转/分钟振荡培养。第二天，将一毫升培养物转移至1.5毫升微量离心管中，在4,500 ×g条件下离心约两分钟，使细胞沉淀，随后吸除上清液，再将细菌沉淀重悬于一毫升100%乙醇中。将乙醇悬浮的细胞在室温下孵育10分钟，然后按前述方法再次离心收集细胞。将沉淀物重悬于一毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中。离心后，吸除上清液，再将沉淀物重悬于一毫升无菌蒸馏水中。最后，稀释细胞悬液。每20份中取一份用蒸馏水稀释，于负20摄氏度保存，最长可保存一个月，直至准备进行PCR反应体系的配制与分装。PCR反应体系的配制与分装必须在物理上独立的房间内进行，最好在配备有紫外灯的专用PCR工作站中操作。首先，使用紫外灯照射并用10%次氯酸钠溶液擦拭工作台面，以对工作区域进行去污染。随后，使用专用于PCR实验的移液器，并配装带滤芯的移液器吸头进行操作。首先用蒸馏水将引物稀释至5 × 10⁻⁴ M，配制引物母液。然后将母液用蒸馏水按1:20比例稀释，得到25 µM的工作浓度。从冰箱中取出PCR试剂和全细胞模板，在冰上解冻。在需要使用之前，将 tac DNA 聚合酶保存在冷冻柜中。根据书面方案中的表一配制 PCR 试剂。接着，用移液器吸取九微升 PCR 反应液。将试剂加入无菌的96孔圆底聚苯乙烯微孔板的各孔中。从第一列的顶部开始，沿列向下进行，然后移至下一列的顶部，在第一个孔中加入1 µL蒸馏水作为阴性对照。随后，向第二个孔中的PCR混合液加入0.5 µL的阳性对照模板，向第三个孔加入1 µL的大肠杆菌K-12 DH5α。将第三个样本模板的1 µL加入至其余各孔中，用于H1I和gyp PCR。沙门氏菌Salmonella enterica、CVaR、TYM和Enteritis将分别作为I和GM等位基因的阳性对照。沙门氏菌CVaR、heidelberg和haar将作为第二轮H1等位基因分型PCR中的阳性对照，用于分别检测r和z10等位基因。接下来，将容量为10 µL的玻璃毛细管放入Idaho技术公司指定的支架中。将快速循环仪固定在支架上后，通过将玻璃毛细管接触孔板底部，向每根毛细管中加入PCR反应混合液。倾斜支架，使液体沿管壁向下移动，从而在毛细管两端与PCR混合液之间留出空间。在使用丁烷喷灯对玻璃管进行热封以封闭毛细管两端之前，先将毛细管和支架放入爱达荷技术公司的快速循环仪中，并按照书面实验方案中表一描述的热循环程序，针对不同类型的全ELO PCR运行相应的程序。当热循环程序完成后，按照标准操作步骤，进行15厘米×10厘米、1.5%分子生物学级琼脂糖凝胶电泳，凝胶中含溴化乙锭。待凝胶完全凝固后，将凝胶转移至含有1倍浓度TAE电泳缓冲液的浸没式水平电泳槽中，并预先混入200 µL浓度为0.25 mg/mL的溴化乙锭。取40微升6倍DNA上样染料，加入4.8微升预混DNA分子量标记物，加样至第一、中间及最后一个加样孔中。接下来，从支架上取下一支含有PCR样品反应液的玻璃毛细管，用玻璃切割器在毛细管两端划痕。然后用双手的拇指和食指分别捏住毛细管上被玻璃切割器划痕的部位，折断毛细管。将毛细管分配器置于与PCR反应混合液相对的一端，缓慢顺时针旋转活塞，直至液体到达管底。 将毛细管插入待上样的孔中，缓慢顺时针旋转活塞，将定量的样品加入凝胶孔中。注意不要用毛细管刺穿孔底，也不要在线性样品完全离开毛细管后继续旋转活塞，以免在孔中引入气泡。所有样品和标准品上样完毕后，将电源的恒定电压设置为90伏。电泳完成后，将凝胶转移至紫外透射仪上，以观察DNA片段和分子量标准品，并使用凝胶成像系统（Gel Dock XR）采集图像。最后，将毛细管架放入10%次氯酸钠溶液中浸泡15至30分钟，用蒸馏水冲洗三次，然后放回PCR准备室晾干。这第一块溴化乙锭染色凝胶显示了与沙门氏菌肠炎亚种肠炎血清型海德堡相关的 O 等位基因的多重 PCR 结果。第 1 泳道和第 13 泳道含有 100 个碱基对的 DNA ladder。第二泳道包含O等位基因B、C1、C2、D1和E的多重PCR对照。其余第三至第十二泳道包含沙门菌分离株。根据扩增片段与PCR对照的大小匹配情况，以及从左至右所用等位基因特异性引物组预测的结果，为各沙门菌分离株指定相应的等位基因。这些扩增片段的大小如下：D1为620个碱基对，C2为400个碱基对，E1为280个碱基对，C1为340个碱基对，B为560个碱基对。该铱溴化物染色凝胶显示了用于鉴定 FLA 凝胶中等位基因眼和 gm 的 H1 等位基因多重 PCR 的结果。加样顺序与之前所示相同。同样，根据每个条带是否出现与 PCR 对照大小相匹配的扩增产物，并结合从左到右使用的四种 H1 等位基因引物组的预期结果，为每个分离株指定相应的 H1 等位基因。扩增片段大小分别为GM 310个碱基对和I 510个碱基对。该脊髓动脉瘤溴化物染色凝胶显示了用于鉴定gelin等位基因r和z 10的H1等位基因多重PCR结果。同样，凝胶加样方式与之前所示相同，根据每个分离株是否出现与PCR对照大小相符的扩增片段，为其分配相应的H1等位基因。如所预测的，使用四组H1等位基因引物时，扩增片段大小分别为R 170个碱基对和Z10 360个碱基对。掌握之后即可顺利进行。如果操作得当，该技术可在四小时内完成。进行此操作时，需注意将模板制备、PCR 体系构建以及凝胶电泳在物理空间上相互分离，以尽量减少 PCR 污染残留的可能性。

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一种用于鉴定的等位基因分型PCR 鼠伤寒沙门氏菌血清型肠炎沙门菌、哈达尔沙门菌、海德堡沙门菌和鼠伤寒沙门菌

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