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$$\longrightharp{xx}$$,
从包含硅基质的碟子开始,该碟具有连接到入口和出口端口的多个小通道。
通过入口注入具有排斥活性的测试蛋白以填充通道。
孵育以使蛋白质粘附在通道区域,形成测试蛋白质区,然后洗涤。
除去基质,用具有吸引力活性的对照蛋白覆盖包被区域,然后孵育。
这有助于对照蛋白粘附在测试蛋白区之间的空白区域,创建具有交替条纹图案的对照蛋白区,然后洗涤。
加入层粘连蛋白覆盖条纹区域,然后清洗。
用海马神经元的单细胞悬浮液接种包被区域并孵育。
在测试蛋白质区,神经元与蛋白质相互作用,触发信号,导致神经元排斥,抑制其附着。
相反,对照蛋白区的神经元-蛋白质相互作用促进神经元附着,支持其生长和轴突延伸。
在
PBS中制备荧光标记的重组蛋白。为每个条纹盘制作 25 微升。让混合物在室温下孵育 30 分钟。接下来,对于每个培养皿,装入一个 22 号注射器,装入 25 微升稀释的蛋白质,并通过基质侧面的小孔注射
。
避免将气泡注入基质中,因为它们会干扰蛋白质与疾病的结合。
现在,将培养皿在细胞培养箱中以 37 摄氏度孵育 30 分钟。孵育后,将 300 微升 PBS 沉积到每个基质的顶部狭缝中。然后,从位于每个基质侧面的小孔中吸出 PBS,以去除所有未连接的重组蛋白。不要完全吸出PBS,因为蛋白质会变干。
总共执行此 PBS 冲洗 3 次。接下来,小心地从每个盘子上取出基质。然后,立即在整个条纹区域添加约 100 微升对照蛋白,在每个培养皿上形成一个替代涂层。
接下来,将培养皿在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。同时,在冰上,以每毫升 20 微克的 PBS 解冻层粘连蛋白。30分钟后,用PBS洗碗3次。然后,在每个盘子上涂上约 100 微升冷层粘连蛋白,然后将盘子放回培养箱中再放置一个小时。
一小时后,再次用PBS洗碗三遍。第三次洗涤后,向每个培养皿中加入约 150 微升培养基。然后,将培养皿在 5 摄氏度的 37% 二氧化碳培养箱中孵育,直到下次需要。使用血细胞计数器计数细胞,并在每个准备好的条纹板上的 150 微升培养基中播放 10,000 个神经元。小心地沉积悬浮液以覆盖整个条纹区域。