从脑组织提取物中分离淀粉样纤维

取含有非淀粉样蛋白和淀粉样纤维（一种不溶性蛋白质聚集体）的小鼠脑组织提取物。

加入固体蔗糖并混匀，以增加溶液的密度。

转移后离心，以分离较重的蛋白质与碎片。

弃去上清液，将沉淀重悬于更高蔗糖浓度的缓冲液中，混匀后离心。

收集含有少量淀粉样纤维的上层液体至新的离心管中，加入洗涤缓冲液并混匀。

现在，弃去中间层，将富含淀粉样纤维的沉淀物转移至含有上层组分的离心管中，以实现最大程度的分离。

离心合并的组分，弃去上清液。加入消化缓冲液，孵育以特异性降解非淀粉样蛋白。

离心并弃去上清液。洗涤沉淀以去除残留的消化蛋白。

将沉淀重悬于含有去垢剂的蔗糖基溶解缓冲液中，以溶解残留的非淀粉样蛋白。

离心，去除上清液，并重新悬浮分离得到的淀粉样纤维。

首先，将新鲜解剖或速冻的脑组织区域放入含有六至八颗陶瓷珠和新配制的冰浴匀浆缓冲液的2毫升离心管中。然后，使用珠磨匀浆器以4,000 RPM进行匀浆，设置两个循环，每个循环脉冲30秒，暂停30秒。接着，将1毫升脑组织匀浆液转移至15毫升离心管中，加入9毫升冰浴匀浆缓冲液，并用实验室封口膜密封。

为确保充分溶解，将试管置于4摄氏度下旋转过夜。次日，向组织提取物悬液中加入固体蔗糖，使其终浓度为1.2摩尔。充分混匀后，在250,000倍重力下离心 g 4°C 下孵育 45 分钟。弃去上清液后，用含有 1.9 M 蔗糖的 2 毫升匀浆缓冲液重悬沉淀物，通过吹打混匀，然后在 125,000 × g 条件下离心 g 45分钟，4摄氏度

离心后，将上层白色固体层转移至新离心管中，加入1毫升预冷的洗涤缓冲液，通过反复吹打数次使其溶解。由于沉淀物中也富含淀粉样纤维，弃去中间的水相层，并将沉淀物与上层固体合并以提高得率。将合并后的组分在8,000 × g条件下离心 g 4摄氏度下孵育20分钟。

弃去上清液后，将沉淀重悬于1毫升冰预冷的消化缓冲液中，并在涡旋振荡器上于室温孵育3小时。再次离心样品，然后用1毫升冰预冷的Tris缓冲液将沉淀洗涤两次，每次洗涤后均需再次离心。第二次洗涤后，通过移液上下吹打将沉淀重悬于1毫升溶解缓冲液中，并立即在4摄氏度下以200,000 × g 离心60分钟。

保存沉淀，然后通过向 supernatant 中加入 50 毫摩尔 Tris 缓冲液，将蔗糖浓度从 1.3 摩尔降至 1 摩尔。再次离心 supernatant，随后将两个沉淀均溶解于含有 0.5% SDS 的 100 微升 Tris 缓冲液中。对于淀粉样蛋白的纯化，使用水浴超声仪通过超声波处理 20 个循环，使富含淀粉样蛋白的沉淀溶解。然后立即在 4 摄氏度条件下以 20,000 × g 离心 30 分钟。

将沉淀重悬于500微升0.5% SDS Tris缓冲液中，重复洗涤四次。最后一次离心后，用200微升超纯水洗涤沉淀，并在20,000 × g下离心 g 在4摄氏度下孵育30分钟，以去除任何残留的去垢剂。将含有纯化淀粉样纤维的最终沉淀物溶解于100微升超纯水中。