小脑类器官切片的荧光免疫染色

取包含不同类型小脑神经元的固定小脑类器官切片。

用缓冲液洗涤切片，以去除残留的包埋介质。

用甘氨酸孵育以阻断固定的残留反应位点，减少免疫染色过程中的非特异性结合。

加入非离子型去污剂以通透细胞。

用缓冲液洗涤，去除多余的去污剂。

现在，将玻片干燥。将其转移至含有缓冲液浸湿的滤纸的免疫染色皿中，以防止组织干燥。

加入封闭液，以结合神经元上的非特异性位点。

移除封闭液。加入一抗进行孵育，使其与小脑神经元内的目标抗原结合。

用缓冲液洗涤，去除未结合的抗体。

孵育荧光染料标记的二抗，以结合抗原结合的一抗。

然后用缓冲液洗涤，去除未结合的抗体。

加入染料以染色细胞核。

利用荧光显微镜观察小脑神经元中表达的标志物，以指示类器官的成熟程度。

用 50 毫升 1× PBS 将含有类器官切片的载玻片洗涤 5 分钟。然后将载玻片转移至含有新鲜 1× PBS 的考普林瓶中。再将载玻片转移至含有 50 毫升新鲜配制的甘氨酸溶液的考普林瓶中，在室温下孵育 10 分钟。

然后，将切片转移至含有50毫升0.1% Triton的考普林瓶中，在室温下透化10分钟。用1×PBS洗涤切片两次，每次5分钟。在免疫染色皿中放入浸透1×PBS的3毫米滤纸。

用纸巾在切片周围将载玻片擦干，并将其放置在3毫米滤纸上。用巴斯德移液管向每张载玻片加入0.5毫升封闭液。室温孵育30分钟后，除去多余的封闭液，并用纸巾在切片周围将载玻片擦干。

在每张载玻片上加入50微升稀释的一抗，并加盖盖玻片。将载玻片放入预先准备好的免疫染色盒中，在4摄氏度下孵育。

经过过夜孵育后，将载玻片转移至含有50毫升TBST的考普林瓶中，使盖玻片自然脱落，随后用TBST洗涤载玻片三次，每次五分钟。在每张载玻片上加入50微升稀释的二抗，并盖上盖玻片。

将切片放入先前准备好的免疫染色皿中，在室温下避光孵育30分钟。再次将切片转移至玻片染色缸（Coplin jar）中，用50毫升TBST洗涤三次，每次5分钟。使用巴斯德移液管，在每张切片的整个表面加入0.5毫升DAPI溶液，在室温下孵育5分钟。