通过双染色法评估小脑神经元培养物中的神经元活力

从经过抗有丝分裂试剂处理的培养板开始，该试剂可抑制胶质细胞生长，从而主要保留小脑颗粒神经元和少量胶质细胞。

移除培养基，并缓慢加入冷的磷酸盐缓冲液（PBS）以维持细胞活性。

更换为冷的染色液并孵育。

该混合物含有荧光素二乙酸酯（FDA），一种非荧光性化合物，以及碘化丙啶（PI），一种不能穿透细胞膜的荧光染料。

FDA 扩散进入细胞，活细胞内的功能酯酶将其转化为一种绿色荧光化合物。

PI 通过受损的细胞膜进入死细胞，与 DNA 结合后发出红色荧光。

移除染色液，并加入冷的 PBS 以防止细胞干燥。

获取FDA和PI染色的荧光图像以及相差图像。将FDA和PI图像合并。

然后将此荧光图像与相差图像进行比较，这有助于排除较大的胶质细胞。

红色荧光表示神经元死亡，而绿色荧光表示神经元存活。

开始染色时，将荧光素二乙酸酯（fluorescein diacetate）加入10毫升PBS中，使其终浓度为10微克/毫升，同时加入碘化丙啶（propidium iodide），使其终浓度为50微克/毫升。将FDA-PI溶液涡旋混匀后置于冰上。将培养板也置于冰上。

小心吸取培养基，注意不要用移液枪头触碰细胞。然后缓慢加入预冷的 PBS。吸去 PBS，再加入预冷的 FDA PI 或 FDA PI Hoechst 工作液。将培养板置于冰上孵育 5 分钟。接着，吸去 FDA PI 或 FDA PI Hoechst 工作液后，向每孔加入预冷的 PBS。

确保荧光显微镜已正确设置。使用100至300毫秒的曝光时间及2.8X的模拟增益，分别在520、620和460纳米处检测FDA、PI和Hoechst的荧光发射。采集荧光图像后，切换至相差模式在普通光下拍摄一张图像。

对于 FDA 与 PI 双重染色，使用图像编辑软件将 FDA 阳性图层拖至 PI 阳性图层上方以叠加细胞图像。通过在不透明度字段中输入 50%，调整 FDA 阳性图层的不透明度 层 面板。通过打开合并两个图层 层 菜单并点击 合并 可见 按钮。在对比度字段中输入 50，以设置叠加图像的对比度 图像， 调整， 亮度/对比度 检查叠加图像中是否存在 FDA 和 PI 双阳性细胞。

对于 FDA、PI 和 Hoechst 三重染色，再次将 FDA 阳性层拖动到 PI 阳性层上，调整 FDA 阳性层的不透明度，并像之前一样合并图像。然后，将 Hoechst 阳性层拖动到合并后的图像层上。

在 图层 面板的不透明度字段中输入 50%，调整 Hoechst 阳性图层的不透明度，并通过打开 图层 菜单并点击 合并可见图层 按钮来合并两个图层。通过比较 荧光 模式和 相差 模式下拍摄的图像，从形态上区分体积较大、形状不规则的胶质细胞与小脑颗粒神经元。