通过免疫染色可视化果蝇大脑中的蘑菇体神经元

将野生型和突变果蝇大脑放入含有固定剂和洗涤剂的溶液中。轻轻摇晃孵育。

固定剂保留组织形态，而洗剂则透化细胞膜。

让大脑安定下来，然后取出溶液。

用缓冲液清洗组织。

添加封闭溶液以防止非特异性抗体结合。

取出溶液并添加针对调节大脑蘑菇体或 MB 神经元轴突发育的特定蛋白质的一抗。

孵育以促进抗体结合。

用缓冲液洗涤以去除未结合的抗体。

与靶向一抗的荧光团偶联二抗孵育。

再次洗涤以去除未结合的抗体，然后将大脑重悬于封片培养基中。

大脑安装在桥式载玻片上，并在荧光显微镜下观察它们。

野生型相比，突变型大脑表现出有缺陷的表型，轴突投射错误和 MB 叶缺失。

显微镜下，使用P200移液器将10至15个相同基因型的解剖大脑转移到装有PTN稀释的4%多聚甲醛的0.5毫升微量离心管中。然后，在室温下缓慢摇动，将大脑孵育20分钟。固定后，让大脑沉降到管底部，然后取出固定剂。

接下来，每次洗涤用 500 微升 PTN 进行两次快速洗涤。一旦大脑在管中安顿下来，就更换 PTN。接下来，在室温下轻轻搅拌，用 PTN 进行 3 次长时间洗涤。

这些洗涤后，大脑可以在 4 摄氏度的 PTN 中储存过夜。去除最后一次PTN洗涤液后，在室温下将大脑在0.5毫升封闭溶液中孵育至少30分钟，并轻轻搅拌。除去封闭溶液后，加入在封闭溶液中稀释的一抗，在4摄氏度下轻轻搅拌将大脑孵育两天。

使用5洗涤PTN洗涤方案去除一抗，然后应用二抗。让这些抗体在室温下与组织一起孵育三个小时，同时通过摇摆遮光

二抗溶液中孵育大脑后，应用PTN洗涤团，每次洗涤后用箔纸覆盖样品，最后去除尽可能多的缓冲液。接下来，加入 75 微升荧光防褪色封固剂，将大脑和培养基流入和流出移液器吸头一次。然后可以用箔纸包裹管子并在 4 摄氏度下储存几天，但理想情况下，直接进行安装。

要安装大脑，请建造一个桥滑梯。将两个相距约 1 厘米的底座盖玻片放在带正电的载玻片上。确保带正电的载玻片正面朝上。然后，用指甲油将盖玻片粘在载玻片上，让指甲油完全干燥后再继续。

接下来，将载玻片放在体视显微镜下，并将大脑和培养基移液到盖玻片之间的空间中。一定要调整照明以提高大脑的可视化。

接下来，从载玻片中吸出额外的安装介质，小心避开大脑。然后，吸走剩余的多余安装介质。这将使大脑能够更精确地定位。

现在使用镊子，将大脑定向成网格图案，触角叶朝上。然后，在大脑上放一块盖玻片，并使用指甲油密封连接到底座盖玻片的顶部盖玻片的边缘。现在，用新鲜的封片介质滴下加载中心腔，使介质通过毛细管作用被拉到盖玻片下。填满空腔后，使用透明指甲油将其完全密封。