0 次观看 • 5:20 分钟 • July 8th, 2025
将野生型和突变型 Drosophila 大脑置于含有固定剂和去污剂的溶液中，轻轻振荡孵育。
固定剂可保存组织形态，而洗涤剂则可使细胞膜通透。
让脑组织沉降，然后移除溶液。
用缓冲液洗涤组织。
加入封闭液以防止非特异性抗体结合。
移除溶液，加入靶向脑内蘑菇体（MB）神经元中调控轴突发育的特定蛋白的一抗。
孵育以促进抗体结合。
用缓冲液洗涤以去除未结合的抗体。
使用针对一抗的荧光染料标记的二抗进行孵育。
再次洗涤以去除未结合的抗体，然后将脑组织重悬于封片介质中。
将脑组织置于桥式载玻片上，并在荧光显微镜下观察。
与野生型相比，突变体大脑表现出缺陷表型，具有轴突错误投射和缺失的蘑菇体叶。
在显微镜下，使用 P200 移液器将 10 至 15 个相同基因型的解剖脑组织转移至含有用 PTN 稀释的 4% 多聚甲醛的 0.5 毫升微量离心管中。然后，在室温下缓慢振荡孵育脑组织 20 分钟。固定完成后，让脑组织沉降至管底，随后移除固定液。
接下来，每次用500微升PTN快速洗涤两次。脑组织在管中沉降后立即更换PTN。随后，在室温下用PTN轻轻振荡，进行三次长时间洗涤。
经过上述洗涤步骤后，脑组织可在PTN中于4摄氏度保存过夜。除去最后一次PTN洗涤液后，将脑组织加入0.5毫升封闭液中，在室温下轻轻振荡孵育至少30分钟。除去封闭液后，加入用封闭液稀释的一抗，于4摄氏度轻轻振荡孵育两天。
使用5次PTN洗涤程序去除一抗，然后加入二抗。将组织在室温下避光振荡孵育三小时。
将脑组织在二抗溶液中孵育后，应用PTN洗涤程序，每次洗涤后用铝箔包裹样本，并在最后尽可能去除缓冲液。接着，加入75 µL荧光抗淬灭封片剂，用移液器吸头将脑组织和封片剂轻轻吹打一次。随后可将离心管用铝箔包裹，于4°C保存数天；但理想情况下，应立即进行封片。
为了安装脑组织，需制备一个桥式载玻片。将两张基底盖玻片放置在带正电荷的载玻片上，两者间距约为1厘米。确保带正电荷的载玻片正面朝上。然后用指缘指甲油将盖玻片粘附在载玻片上，并在继续操作前让指甲油完全干燥。
接下来，将载玻片置于体视显微镜下，用移液器将脑组织和培养基转移到盖玻片之间的空隙中。务必调整照明条件，以增强脑组织的可视性。
接下来，吸去载玻片上多余的封片介质，注意避免接触脑组织。然后用吸水纸吸除残留的多余封片介质。这样可使脑组织定位更加精确。
现在使用镊子将脑组织按网格排列，使其嗅觉叶朝上。然后将盖玻片覆盖在脑组织上，并用透明指甲油密封顶部盖玻片与底部盖玻片相接的边缘。接着，逐滴向中心腔室加入新鲜封片剂，使封片剂通过毛细作用渗入盖玻片下方。当腔室充满后，用透明指甲油完全密封。