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神经科学
0 次观看 • 3:51 分钟 • July 8th, 2025
取含培养基的多孔板中的小胶质细胞培养物。
向测试孔中加入含银纳米颗粒的培养基，替换原培养基的一半；向对照孔中加入等量溶剂培养基。孵育。
小胶质细胞内化这些纳米颗粒后被激活，并释放促炎性细胞因子。
将含有这些细胞因子的对照培养基和条件培养基转移至装有滤器的收集管中。
离心以去除纳米颗粒，保留细胞因子。
将滤器倒置放入新的收集管中，离心并收集滤液。加入新鲜培养基。
接下来，取下丘脑神经元培养物。
将对照孔中的培养基更换一半为溶剂对照培养基，将测试孔中的培养基更换为条件培养基。孵育。
细胞因子与下丘脑神经元上的受体结合，激活信号通路，从而诱导神经元死亡。
加入刃天青并孵育。
在活细胞中，脱氢酶将弱荧光的刃天青还原为荧光的试卤灵。
测量荧光。
荧光减弱表明下丘脑神经元死亡增加，提示纳米颗粒诱导的神经毒性。
首先，从每孔培养板中收集 200 微升上清液，并将其加载到置于微量离心管上方的滤膜上，以去除纳米颗粒。
需要记住的是，在过滤纳米颗粒时，其大小、形状和浓度会影响过滤效率，因此建议预先进行过滤测试。
现在，在室温下以14,000 g 离心15分钟。然后弃去滤过液（其中含有纳米颗粒），并将滤膜倒置放入新的收集管中。以1,000 g 反向离心滤膜2分钟，以收集含有细胞因子的浓缩条件培养基。
接着，用新配制的添加物DMEM将收集液体积补至400微升，并将试管置于冰上保存。对于本实验，使用建立小胶质细胞培养物所描述的相同方法，从冻存菌种中建立下丘脑细胞。最终，用含补充物的DMEM每孔200微升，以每孔5,000个细胞的密度接种于黑色壁、透明底的培养板中。
培养24小时后，移除100微升培养基，并加入100微升从活化的小胶质细胞培养物中收集的过滤浓缩培养基。然后在标准条件下将培养板继续孵育24小时。次日，向每孔加入22微升刃天青试剂，再继续孵育20分钟。随后使用多功能分光光度计检测荧光值，以相对荧光单位评估细胞活力。