使用荧光成像技术观察神经元中囊泡的运动性

取所需质粒置于无血清培养基中。该质粒编码带有荧光标签的囊泡特异性蛋白。

在另一个离心管中，加入用无血清培养基稀释的转染试剂。

混合两种溶液并孵育。

转染试剂与质粒结合，形成复合物。

取一孔含有贴壁神经元的培养液（含血清），加入复合物并进行孵育。该复合物可促进质粒进入细胞。

弃去培养基以去除未内化的复合物。

加入新鲜培养基，然后孵育。

质粒进入细胞核后被转录，随后翻译成囊泡特异性的荧光蛋白，从而标记神经元中的囊泡。

在控温条件下使用荧光显微镜，按指定时间间隔采集图像。

为了分析图像，需定义追踪参数。

确定目标囊泡，并记录其在每幅图像中的坐标。

整理数据以可视化囊泡的运动。

在此步骤中，将4微克质粒与200微升无血清培养基混合。在另一管中，将8微升转染试剂溶于200微升无血清培养基中。然后在室温下孵育5分钟。5分钟后，将质粒溶液与转染试剂溶液混合，并在室温下孵育20分钟。随后，将混合物加入包被的玻璃底培养皿中。

将神经元在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。随后，更换为 2 毫升大脑皮层培养基，将神经元在 37 摄氏度下继续孵育一至两天。

成像时，使用配备 CCD 相机和 40 倍物镜的荧光显微镜。通过培养系统将温度保持在 37 摄氏度。由图像采集软件控制，在 100 秒的时间内每 5 秒采集一次神经元图像，共采集 20 帧。

为了分析图像，使用 ImageJ 软件通过手动追踪功能打开所有连续图像。要合并这些连续图像，请选择 图像，然后依次选择 堆栈 和 图像到堆栈，然后单击 确定。随后，选择 插件，然后选择 手动追踪。此时将弹出一个追踪窗口。勾选 显示参数 复选框，并在参数部分中定义追踪参数。

然后，单击添加轨迹以开始创建新的轨迹。确定目标囊泡后，在连续图像中信号的中心位置单击，以记录其 XY 坐标。重复此操作，采集所有连续图像中囊泡的 XY 坐标。每次选定参考点后，图像将自动跳转至下一幅。