0 次观看 • 4:55 分钟 • July 8th, 2025
取人胚胎干细胞（hESCs），置于包被有细胞外基质的培养瓶中。
用神经诱导培养基替换原有培养基，孵育后将人胚胎干细胞分化为神经前体细胞（NPC）集落。
加入酶解溶液以解离集落。
离心，弃去上清液，然后在含有生长因子的诱导培养基中重悬细胞，以支持神经前体细胞（NPC）的分化。
将细胞悬液加入倒金字塔形微孔中，以形成三维神经球。
将神经球转移至包被有细胞外基质并含有生长因子和小分子的分化培养基的培养板中。在振荡条件下孵育，以促进其向多巴胺能前体神经元分化。
将培养基更换为神经成熟培养基，并将神经球置于培养板插件中的膜圆片上，以允许空气和营养物质的扩散。
在静态条件下孵育，以形成由成熟多巴胺能神经元组成的三维类器官。
这些模拟发育中大脑的类器官可用于研究帕金森病的特征性表现——多巴胺能神经元的退化。
将用于维持hESCs多能性特征的干细胞培养基更换为含有双SMAD抑制剂混合物的无血清培养基，以启动神经诱导，并在次日传代时加入10微摩尔ROCK抑制剂以提高细胞存活率。在第1天，用每孔2.5毫升含有相同浓度ROCK抑制剂和双SMAD抑制分子的无血清培养基准备微孔板。
为了使细胞向神经管腹侧模式分化，加入浓度为每毫升100纳克的SHH和FGF8，以及2微摩尔的smoothened激动剂。添加培养基后，以1,200 × g 离心5分钟，以去除微孔中的气泡。当微孔板准备好使用并装有一半分化培养基时，移除hESC的培养基，并用不含钙和氯化镁的PBS快速洗涤。
通过向T75培养瓶中加入7.5 mL重组酶溶液，将细胞集落解离为单细胞悬液。在37摄氏度下孵育细胞2分钟，然后加入7.5 mL DMEM/F-12培养基。随后收集细胞悬液，在300 × g 条件下离心5分钟。接着弃去上清液，并使用制备微孔板时所用的相同培养基对细胞进行计数。
调整培养基体积以制成细胞悬液，使每个微孔中形成含有1000个细胞的神经球。具体操作为：将470万细胞重悬于2.5毫升培养基中，然后加入此前已置于培养板中的2.5毫升培养基。为使细胞均匀分布至各微孔，轻轻振荡培养板，并在300 × g 条件下离心5分钟。随后，将培养板置于37°C孵育24小时，以促进球体形成。
第二天，用培养基轻轻冲洗微孔，并将细胞球转移至经组织培养处理的六孔板中。将细胞球置于37摄氏度条件下旋转培养，每两到三天更换一半新鲜培养基。第3至13天，为促进神经诱导并转化为具有中脑特征的神经前体细胞，在培养基中添加3 µM GSK-3β抑制剂。将样本分至两个新的经组织培养处理的六孔板中，以降低细胞球密度，避免细胞球聚集。
第8天，通过更换含生长因子的新培养基开始神经成熟阶段，每两到三天更换一次培养基。第21天，将一个培养插件放入一个新的六孔板中的一个孔内，并在膜插件下方加入1.2毫升用于神经球分化的神经成熟培养基。然后，将PTFE膜置于培养插件上。
最后，为了生成神经类器官，将约100个神经球接种到PTFE膜上，置于气液界面条件下。从这一步开始停止旋转，并每两到三天更换一次培养基，直至达到所需的分化时间点。