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神经科学
0 次观看 • 3:18 分钟 • July 8th, 2025
从含有小鼠胚胎神经元的多孔培养板开始，培养基中进行培养。
神经元在其生长的轴突末端表现出生长锥。这些结构包括称为丝状伪足的细长突起和称为片状伪足的片状延伸部分，它们由细胞骨架组分——肌动蛋白丝和微管——构成。
用聚集的淀粉样蛋白β（amyloid-β，简称Aβ）处理检测孔，用溶剂溶液处理对照孔。
在检测孔中，聚集的 Aβ 与膜受体结合，启动下游信号通路，使细胞骨架调控蛋白发生磷酸化。
磷酸化蛋白会破坏微丝和微管，使生长锥的结构完整性失稳，从而导致其塌陷。
使用固定剂孵育以保存细胞结构，然后洗涤细胞并进行封片以用于成像。
使用显微镜比较测试孔和对照孔中的细胞结构。
Aβ处理的神经元中生长锥塌陷的发生率增加，表明Aβ聚集体具有毒性作用。
至少提前一周开始本实验，取一支新开启的市售全长 A-beta-42 冻干粉，用无菌蒸馏水溶解至浓度为 0.5 毫摩尔。在 37°C 下孵育七天，以诱导其聚集并产生毒性。将聚集后的 A-beta-42 分装成小份，于 -80°C 保存，待用。
在神经元培养的第四天，按照先前所示方法，在B培养基中加入100微升浓度为0.5微摩尔的聚集态A-beta-42或对照溶液，处理孔板1小时。1小时后，移除培养基，并立即在37摄氏度的加热板上用含4%蔗糖的4%多聚甲醛PBS溶液固定神经元1小时。
固定最为重要，因为维持生长锥的形态对于本方案至关重要。
固定后，用 PBS 清洗神经元三次。然后，移除灌流小室，用水溶性封片剂封片。在 4 摄氏度下干燥封片剂两至四天。使用倒置显微镜配备的 20 倍干式物镜拍摄每孔的整个区域。
捕获并分析每个孔中的全部区域对于避免主观性至关重要。
将处于第3或第4阶段的每个神经元中最长的神经突分类为轴突。缺乏片状伪足或丝状伪足少于三条的轴突生长锥被视为塌陷的生长锥。