制备用于回收突触囊泡光学分析的培养神经元

从一个含有表达突触小泡膜蛋白（包括荧光标记的突触素蛋白和突触结合蛋白-1）的培养神经元的盖玻片开始。

移除培养基，加入去极化缓冲液与一抗的混合液，然后孵育。

缓冲液中的离子进入细胞，刺激突触小泡与膜融合，从而暴露突触结合蛋白-1。

一抗选择性结合暴露的突触结合蛋白-1（synaptotagmin-1）。

弃去缓冲液，用培养基洗涤以去除未结合的抗体。

加入新鲜培养基并孵育，以促进膜的内化，形成含有标记的突触素和抗体结合的突触素-1的回收囊泡。

移去培养基，固定细胞并清洗。

引入一种基于去污剂的封闭缓冲液，并结合荧光素标记的二抗。

洗涤剂使细胞通透，从而使二抗能够与结合了抗体的突触结合蛋白-1相互作用。

抬起盖玻片，用水清洗并晾干。

将盖玻片有样品的一面朝下置于载玻片上，加入封片介质，用于双标记再循环囊泡的光学分析。

将 600 微升 1 倍去极化缓冲液和 10 毫升细胞培养基在水浴中预热至 37 摄氏度。向 1 倍去极化缓冲液中加入 1 微升小鼠抗 SYT1 抗体，涡旋振荡 10 秒。从细胞中移除并弃去细胞培养基后，向每孔加入 200 微升去极化抗体混合液。

将培养板置于37摄氏度、5% CO₂的培养箱中孵育5分钟。取出后弃去去极化抗体混合液，用细胞培养基将细胞洗涤3次。每孔加入1毫升细胞培养基，在室温下孵育30秒。

然后，移除 750 微升培养基，并加入等量的新鲜培养基。重复此步骤三次。接着，移除并弃去细胞培养基，加入 300 微升的 4% 多聚甲醛（PFA）1x PBS 溶液。

最后，在 4 摄氏度孵育 20 分钟，然后用 1× PBS 每次 5 分钟，洗涤三次。将荧光标记的二抗用封闭缓冲液按 1:1,000 的比例稀释，每孔加入 200 µL。移除并弃去每个含有培养神经元盖玻片的孔中的 1× PBS。

每孔加入 200 微升封闭缓冲液抗体混合物，在室温下孵育 60 分钟。孵育结束后，用 1 毫升 1× PBS 洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。

接下来，在载玻片上加入一滴7微升的封片剂。用套管提起并用镊子夹住，从24孔板中取出盖玻片。将盖玻片浸入蒸馏水中以去除PBS，并用软纸巾轻轻接触其一端边缘，小心吸干水分。

将盖玻片翻转，使其带有细胞的一面朝下，覆盖在包埋介质液滴上，从而使细胞嵌入包埋介质中。将载玻片置于通风橱中避光干燥1至2小时。将干燥后的载玻片存放在显微镜载玻片盒中，于4摄氏度保存。