0 次观看 • 3:25 分钟 • July 8th, 2025
从经过α-突触核蛋白或α-S聚集体（一种错误折叠蛋白的聚集体）处理的贴壁神经元培养物开始。
这些团块聚集形成细胞内包涵体。
用固定液替换培养基，以保持细胞完整性。
去除固定液，并用缓冲液洗涤。
接下来，加入表面活性剂以通透细胞膜。
去除表面活性剂，并用缓冲液洗涤。
加入封闭液以防止非特异性抗体结合。
现在，加入可特异性结合α-S包涵体和结构蛋白的一抗进行孵育。
用缓冲液洗涤以去除未结合的抗体。
使用荧光标记的二抗进行孵育。
去除未结合的抗体。
加入荧光染料以标记细胞核。
去除染料，并用缓冲液洗涤。
使用封片介质将带有神经元的盖玻片封固在载玻片上。
在荧光显微镜下，观察神经元内经免疫标记的α-S包涵体。
在化学通风橱中进行免疫荧光实验时，将神经元用含5%蔗糖的2%多聚甲醛PBS溶液在室温下固定15分钟，期间不摇动。15分钟后，移除固定液，并用PBS短暂洗涤神经元三次。
接下来，在室温下用含0.3%非离子型表面活性剂的PBS孵育神经元5分钟以进行通透处理。然后用PBS短暂洗涤神经元三次。在室温下，将神经元置于含3%胎牛血清（FBS）的PBS中，在旋转摇床上孵育30分钟，以封闭非特异性结合位点。随后，在4摄氏度的冷室或冰箱中，将神经元与适当的一抗溶液（溶于含3% FBS的PBS中）在旋转摇床上避光孵育过夜。
第二天，移除抗体溶液，用 PBS 将细胞快速洗涤三次。然后，在避光条件下，于室温下将神经元与溶于含 3% FBS 的 PBS 中的适当荧光标记二抗在摇床上孵育 1 小时。
移除抗体溶液，用 PBS 短暂洗涤三次。接下来，在避光条件下，于室温下将神经元置于摇床上用 DAPI 溶液染色 15 分钟。15 分钟后，移除抗体溶液，再用 PBS 短暂洗涤三次。使用抗荧光淬灭封片剂将盖玻片封固在载玻片上。