0 次观看 • 3:30 分钟 • July 8th, 2025
取一个含有转染哺乳动物细胞的多孔板。
这些细胞表达嗅觉神经元的气味受体（OR），即一种G蛋白偶联受体，同时还表达含环磷酸腺苷（cAMP）结合域与突变型荧光素酶融合的cAMP生物传感器。
移除培养基，并用缓冲液洗涤以去除残留的培养基。
加入含有cAMP生物传感器底物的缓冲液。孵育以促进底物进入细胞。
使用化学发光酶标仪，测定细胞的基础发光强度。
向各孔中加入浓度递增的测试气味物质，留一孔不加处理作为对照。
气味分子与OR结合，触发产生cAMP的信号级联反应。
这种cAMP会结合到生物传感器的结合结构域，激活荧光素酶，后者与底物相互作用从而发出光信号。
实时测量发光信号。发光信号随气味分子浓度升高而增强，表明气味分子激活了嗅觉受体。
刺激前，在相差显微镜下观察转染的细胞，确保每孔细胞融合度在50%至80%之间，然后放回培养箱。随后，通过向Hank's平衡盐溶液中加入10 mmol/L HEPES和5 mmol/L葡萄糖，制备刺激用培养基。将实时cAMP检测底物试剂的55 µL分装液置于冰上解冻。
通过混合55 µL底物试剂与2,750 µL刺激培养基，配制2%平衡溶液。在实验台面上铺好一层厚的纸巾，将培养板倒置后轻轻并反复在纸巾上轻敲，使转染培养基被纸巾吸收。通过移液枪向每孔加入50 µL刺激培养基，对细胞进行洗涤。
轻柔地反复吸打96孔板中的刺激液。每孔加入25微升2%平衡溶液，置于室温避光孵育2小时。在孵育结束前，将解冻的气味物质储备液用刺激液稀释至工作浓度。
在添加气味物质之前，使用化学发光酶标仪测量孔板的基础发光水平。迅速将孔板从酶标仪中取出，并向每孔加入25微升的气味物质稀释液。随后，立即开始对所有孔进行连续发光检测，在30分钟内完成20个循环的测量。