向大鼠黑质注射病毒载体以建立神经退行性疾病模型

将麻醉后的大鼠固定于立体定位仪中。

对头皮进行消毒，并做颅骨正中切口以暴露颅骨。

确定颅骨上的两个参考点——前囟（bregma）和后囟（lambda），以定位注射位点。

准备一支含有病毒载体悬浮液的显微注射器。

病毒载体携带编码α-突触核蛋白的转基因，该蛋白在神经退行性疾病中会发生错误折叠并在黑质神经元中聚集。

将连接至微量注射泵的注射器置于立体定位仪中。

在注射部位钻一个骨孔，避免脑组织损伤。

用针头刺穿硬脑膜，并用无菌纱布清除任何血液。

将显微注射针穿过颅骨钻孔，到达黑质。

缓慢注射病毒悬液，确保分布均匀。

暂停片刻以防止回流，然后缓慢拔出针头。

缝合切口。

该模型现已准备好进行进一步分析。

首先，根据批准的实验方案对一只八周龄的雌性Wistar大鼠进行适当麻醉。通过轻捏每只足掌并观察是否存在回缩反射，来确认已达到外科麻醉水平。接着，使用微型应答器植入器将微型应答器植入大鼠背部。检查微型应答器是否正确放置，并确认能够成功读取信号。

现在剪去大鼠头部的毛发，并在头皮和耳朵部位涂抹局部麻醉剂。将大鼠转移至超净工作台，后续操作均采用无菌技术进行。通过固定耳杆，随后固定口鼻杆，将大鼠置于立体定位仪中。用纸制毯子覆盖大鼠身体，以防止体温下降。涂抹眼用润滑剂，防止眼睛干涩。

接下来，按照批准的程序对头皮进行消毒。此处使用70%异丙醇中的1%碘溶液。在头皮中线处做一个小切口后，轻轻刮除颅骨上的膜状物，并用生理盐水冲洗。待颅骨干燥后，确保前囟和后囟清晰可见。

现在，用重组腺相关病毒（AAV）填充一支10微升、30号针头、20毫米长的微量注射器，并将其安装到与立体定位仪相连的电动微量注射泵上。

为了特异性转导黑质中的多巴胺能神经元，重组腺相关病毒（AAV）载体是首选，因其具有高滴度以及高效转导多巴胺能神经元的能力。

通过释放一滴 AAV 来测试流速。将任何释放出的 AAV 置于多价清洁去污剂中处理。目视检查头部是否在头架中固定端正。然后通过将针尖移动至前囟，沿背腹方向降低针尖直至接触颅骨，测量该位置的高度，以确认颅骨是否平整。在后囟处重复此操作。

将针头回至前囟后，沿前后方向和内外侧方向移动针头至微量注射的立体定位坐标。记录下该坐标值。在注射位点处，如前所述测量颅骨高度，并确保其与前囟高度相差不超过0.3毫米。

然后小心地在颅骨上钻一个2毫米的孔。钻孔完成后，测量硬脑膜的高度，以确定应用背腹向坐标的参考位置。使用26号针头穿透硬脑膜。用无菌纱布吸去任何血液，并在所有出血完全停止后继续操作。

现在缓慢将预装好微注射器的针头插入脑内，到达背腹向坐标后，暂停一分钟。随后以每分钟0.25微升的速度注射3微升AAV。注射完成后，将针头在原位保留5分钟，以防止液体沿针道回流，然后缓慢拔出针头。

使用带涂层的编织聚酯线3.0号缝合头皮，并用70%异丙醇中含1%碘的溶液消毒皮肤，先松开鼻部和口腔固定杆，然后轻轻松开两耳杆，将动物从立体定位仪中取出。此时应给予镇痛药物，必要时给予麻醉逆转剂。随后将大鼠置于洁净的笼子中，放置在设定为38摄氏度的加热板上，并密切监测直至其苏醒。