从人死后脑组织中分离去污剂不溶性蛋白聚集体

从一例确诊的神经退行性疾病病例中获取冷冻保存的死后人脑组织样本开始。

切除富含不溶性蛋白质聚集体的灰质，这是该疾病的特征性表现。

将组织转移至匀浆器中。

加入含有抑制剂的缓冲液，并进行匀浆以释放细胞内组分。

抑制剂可阻断蛋白酶和磷酸酶，防止蛋白质降解。

将匀浆转移至离心管中，并加入离子型去污剂缓冲液。孵育。

去垢剂可溶解天然折叠的蛋白质，而错误折叠的蛋白质聚集体则保持完整。

超声处理以完成细胞解离。

将匀浆转移至超速离心管中，高速离心。

聚集体沉降到底部。

移去含有去垢剂可溶性蛋白的上清液。

用离子去垢剂缓冲液洗涤聚集体，离心并去除上清液。

加入尿素缓冲液以变性蛋白聚集体，使其溶解。

将溶解的蛋白质聚集体转移至离心管中，并进行短暂超声处理，以确保完全溶解。

从健康对照者和经病理确诊的阿尔茨海默病（AD）患者获取冻存的死后脑组织。使用镊子和剃刀从每份组织样本中切取约250毫克的灰质组织。将脑组织片段解冻一分钟。在组织解冻的同时，将其切成大约2立方毫米的小块。转移至预冷的2毫升Dounce匀浆器管中，置于冰上。

请注意避开白质和任何较大的血管。

迅速操作，将组织置于可撕开的一次性称量舟中。为防止组织解冻，需频繁将装有脑组织的称量舟放入盛有干冰的聚苯乙烯容器中。解剖并称量所有所需组织样本后，从干冰中取出一个装有组织样本的称量舟。

接下来，每克组织加入5毫升冰上预冷的低盐缓冲液（含蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物），在冰上使用高间隙研杵A研磨约10次，再用低间隙研杵B研磨15次进行匀浆。然后，用一支9英寸的玻璃巴斯德吸管将每份匀浆转移至已标记的2毫升聚丙烯管中。以类似方式，将剩余匀浆分装至其他标记好的1.5毫升离心管中，于-80摄氏度保存。

进行分步分离时，向每个0.8毫米的等分试样中加入100微升5摩尔的氯化钠和100微升10%的Sarkosyl。通过倒置充分混匀，然后在冰上孵育15分钟。孵育结束后，使用配备微探头的超声波破碎仪，以30%的振幅进行三次、每次5秒的脉冲处理。

使用二辛可宁酸法测定匀浆液的蛋白浓度后，向每个样品中加入含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的预冷 Sarkosyl 缓冲液，使终浓度达到每毫升 10 毫克。然后，将每个样品的 500 微升转移至 500 微升聚碳酸酯超速离心管中。

将离心管放入预冷的转子中，在4摄氏度条件下以180,000 × g 超速离心30分钟。离心结束后，将S1十二烷基肌氨酸钠可溶性上清液转移至1.5毫升离心管中，并于-80摄氏度保存。向含有去污剂不溶性P1组分的超速离心管中加入200 µL sark缓冲液，并用移液器吸头将沉淀从超速离心管底部刮下。

接下来，将重悬的 P1 沉淀转移至新的 500 微升超速离心管中，配平后于 4 摄氏度下以 180,000 × g 离心 30 分钟。弃去 S2 上清液，然后向月桂酰肌氨酸钠不溶性沉淀中加入 50 至 75 微升含蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物的尿素缓冲液，在室温下孵育 30 分钟，以溶解 P2 沉淀。

孵育后，将重悬的 P2 沉淀转移至标记好的 0.5 毫米离心管中，并使用微探头在 20% 振幅下短暂超声 1 秒，使沉淀完全溶解。采用 BCA 法测定十二烷基肌氨酸钠可溶性组分和不可溶性组分的蛋白浓度。