果蝇蛹腹部免疫

该程序的总体目标是准备果蝇 puy 的腹部上皮进行免疫组织化学。这是通过首先双侧解剖 期果蝇 puy 并去除内部器官来实现的，使得只有由增殖的假想组成的腹部上皮。他的成骨细胞和幼虫表皮细胞仍然附着在瞳孔膜上。

然后将组织固定，与从外瞳壳中取出的抗体一起孵育，并通过免疫荧光显微镜观察，以显示腹部上皮的大体形态和目标蛋白质的表达。大家好，我是 John Yoder。我的实验室在阿拉巴马大学生物科学系。

嗨，我们赢了。我是 Yoda 实验室的同龄学生。今天，我们将向您展示我们解剖果蝇的方法、CUPE 和果蝇蛹腹部的免疫组织化学。

该方法可用于研究上皮形态发生和组织重组的过程。我们专门使用这项技术来研究成年果蝇腹部的性二态形态的发展 来自 25 摄氏度的群体小瓶，没有成人识别。最近固定的 puy puy 的角质层尚未开始晒黑被认为是零小时，即 PF。使用湿润的画笔轻轻去除这些 puy 并将它们放在加湿室的盖子上 如有必要，使用画笔和 PBS 轻轻洗去 puer 外壳上的碎屑。

在零小时按性别对 puy 进行排序。PF 雄性刺激原始很容易通过瞳孔角质层看到。大约在身体的三分之二处，雌性 goad primorial 较小，不容易识别。

现在，将 pube 放在加湿室中的湿滤纸上。装回盖子并将其放回恒温环境中。当动物达到感兴趣的发育时间点时，继续进行解剖。

请注意，在 24 至 32 小时处理的 A PF 过程中，脓细胞最容易发生上皮细胞丢失。沿着透明载玻片的一侧贴上一块双面胶带，为解剖做准备。然后用镊子轻轻抓住前球形之间的每个瞳孔，并将它们放在胶带背侧向上。

以这种方式最多排列 10 个 PPE，否则可能会工作得太慢。在 5 到 10 分钟内，PPE 将完全可爱，但在此之前，请使用画笔将它们均匀隔开并平行放置。在这个阶段长时间干燥会降低它们的质量。

所以赶快行动吧。现在使用手术刀解剖双侧每个瞳孔 A。从蛹的前端到后端快速切割。

如果作得当，切割会将前后球形对一分为二，产生对称的左半部分和右半部分，以从胶带上松开脓疱。使用画笔使用手术钳将少量 PBS 涂抹在每个解剖的蛹上。抓住半个蛹的前端，将其浸入解剖显微镜载物台上充满 PBS 的冲洗皿中，同时仍然握住蛹，使用移液器将 PBS 泵入腹腔，轻轻洗去内部组织。

避免施加太大的压力，否则细胞会从上皮中丢失。立即将干净的组织浸入 400 微升室温固定缓冲液中，清洁所有蛹半部。同样，在练习中，解剖和清洗 20 个 PU 半应该需要不到 5 分钟。

让 puy 在室温下在固定缓冲液中孵育 1 小时，然后在 400 μL PBS 中冲洗 3 次，每次洗涤 5 分钟。要先储存样品，请在 100% 甲醇中冲洗两次，然后转移到 100% 乙醇中储存。这些样品可以在零下 20 摄氏度的 100% 乙醇中储存长达三个月，而不会丢失任何细胞或表位反应性。

要处理储存的样品，必须首先通过乙醇系列在 PBS 中对样品进行重新分级。通过在室温下将样品在含 2% BSA 的 PBS 中封闭一小时且不要摇晃来进行免疫组织化学。摇动样品，大大增加腹上皮细胞的损失。

然后用在 PBS 中稀释至适当浓度的一抗替换封闭溶液。将样品在 4 摄氏度下孵育过夜，不要摇晃，并在密闭的加湿室中孵育，以防止第二天蒸发。在 PBS 中洗涤样品 3 次，不要摇晃，每次洗涤 10 分钟。

然后将样品封闭一小时，不要在含 2% BSA 的 PBS 中摇动。用 PBS 中的室温二抗替换封闭溶液。然后将样品在黑暗中孵育 3 小时，不要摇晃。

如果合适，用 3 个 wass 的 PBS 溶液跟踪二抗，每次 10 分钟。对细胞核进行复染，例如，细胞核可以在 PBS 稀释的 DPI 中孵育 10 分钟。接下来，将样品与封片剂相等至少 30 分钟。

要安装样品，请向前抓住每个瞳孔盒，用第二对镊子避开内部瞳孔膜。轻轻抓住头部的内瞳膜。然后轻轻地从瞳孔盒中拉出样品。

将钩子样品转移到装有 75 至 100 微升口腔培养基的凹陷玻片上。单个玻片上可以安装多个样品。现在使用探针和镊子将样品均匀地定位在凹陷中。

旋转它们，使它们的侧面朝上，并用探针去除任何气泡。最后，轻轻地将盖玻片放到样品上，不要在制备过程中引入气泡。结构照明显微镜将与共聚焦技术相媲美。

这是 50 张共聚焦图像的投影，切片之间为 2.5 微米。组织在 26 小时时为 PF，染色显示无翼蛋白和圣杯驱动的 GFP 和细胞核的表达模式。前部在左侧，背侧特征在屏幕顶部。

这部电影演示了该程序如何保留样本的大体形态。从而允许图像堆栈的三维重建。West 掌握了几十个瞳孔，可以在不到 30 分钟的时间内持续存在并放置在固定缓冲液中。

此外，使用该方案制备的样品适合进行杂交，使其成为基因表达研究的有价值的方案。