用于测量人细胞中γ-分泌酶活性的荧光素酶检测

从经过基因改造的人源细胞开始，将其置于生长培养基中。

这些细胞含有一个四环素诱导系统，该系统具有淀粉样前体蛋白（APP）基因和一个荧光素酶基因。

更换为含有四环素的培养基并孵育。

四环素与激活蛋白结合，该激活蛋白可结合至APP启动子。

这会诱导基因表达并产生定位于细胞膜的前体蛋白。

β-分泌酶切割APP，产生一个仍附着在细胞膜上的片段。

γ-分泌酶切割该片段，产生淀粉样β肽并释放一个激活组分。

该激活剂进入细胞核，与荧光素酶启动子结合，诱导基因表达，从而产生荧光素酶。

用含有荧光素酶底物的检测试剂替换培养基。底物扩散进入细胞，与荧光素酶发生反应，产生生物发光。

使用微孔板读数仪测量光强度，该强度直接反映γ-分泌酶活性，该酶在神经病理学条件下至关重要。

使用血细胞计数板对NG或CG细胞进行计数。然后，将细胞以每孔20,000个细胞的密度接种至96孔微孔板中，每孔终体积为200 µL培养基。将微孔板转移至加湿的二氧化碳培养箱中，在37 °C条件下培养过夜。过夜培养后，从每孔中移除100 µL培养基。

每孔加入含有 2 微克/毫升四环素的 100 微升生长培养基，其中分别添加 0.2% 二甲基亚砜、2 微摩尔 CL 387,785、2 微摩尔 DAPT 或其他相关的 ErbB1/ErbB2 抑制剂。将处理后的细胞在 37 摄氏度条件下于微孔板中孵育 24 小时。孵育结束后，从微孔板中每孔移除 150 微升生长培养基。

然后每孔加入 50 微升荧光素酶检测试剂。接着，将微孔板转移至化学发光微孔板检测仪中，并在室温下孵育五分钟。使用化学发光微孔板检测仪中预设的程序检测荧光素酶产生的化学发光信号。