病毒介导的内侧神经节隆起细胞标记及其体内研究中的移植

从基因修饰的小鼠胚胎中收获含有皮层中间神经元前体的内侧神经节隆起组织。

加入阳离子聚合物，并将组织解离为单细胞悬液。

加入携带由lox位点侧接的Cre重组酶依赖性GFP报告基因的慢病毒载体。孵育。

该聚合物可中和病毒和宿主细胞膜上的电荷，从而促进病毒融合及RNA释放。

病毒RNA被逆转录并整合到宿主基因组中。

离心并弃去上清液。吸除多余的培养基。

将细胞转移至疏水表面，并装入注射装置中。

将细胞注射到麻醉后的小鼠幼崽的大脑皮层中。

让幼鼠恢复并生长。

移植的前体细胞在大脑皮层中分化为成熟的中间神经元。

这些中间神经元的一个亚群共同表达 Cre 重组酶和 RFP。

在这些中间神经元中，Cre 会切除 lox 位点，使 GFP 基因翻转并启动其表达。

通过观察RFP和GFP的共表达来鉴定表达Cre的中间神经元。

按照书面实验方案制备慢病毒并分离MGE后，收集MGE的两个半球，将组织放入两个含有500 µL含10% FBS的DMEM的1.5 mL收集管中。

在收集所有组织期间，将样本保持在冰上。然后将试管转移至符合BSL-2标准的生物安全柜中。小心吸除上清液，避免扰动沉降至试管底部的MGE组织。

然后加入约 500 µL 预热的含 10% FBS 的 DMEM 培养基。加入聚凝胺（polybrene），使其终浓度为 8 µg/mL，并用 P1000 移液枪头反复吹打，直至形成单细胞悬液。随后，向每根离心管中加入 15 至 20 µL 浓缩的慢病毒液。

接下来，将每个试管牢固封闭，倒置混匀，然后将所有试管放入37摄氏度的培养箱中。用慢病毒孵育细胞至少30分钟，但不超过1小时，因为更长时间会导致细胞活力下降。每10分钟倒置一次试管。

孵育结束后，从培养箱中取出试管，在4摄氏度下以700 × g离心3分钟，使细胞沉淀。在生物安全二级（BSL-2）操作台中，移去上清液并弃入10%次氯酸钠溶液中。随后加入1毫升含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基，轻柔吹打沉淀2至3次进行洗涤。

按照之前的方法离心后，再重复此洗涤步骤两到三次，以去除过量的病毒。最后一次洗涤后，尽可能吸除上清液，并将每支试管置于冰上。

由于管壁残留培养基，在移植操作开始时，约有 2 至 3 微升的培养基会覆盖在细胞沉淀上。在整个操作过程中须确保无菌操作，用 1 毫升注射器吸取矿物油，然后使用 30.5 号针头将玻璃移液管完全回填矿物油。

接下来，将玻璃移液管连接到立体定位仪上，并将推杆装入其中。在助手使用液压驱动装置的同时，将推杆推入玻璃移液管约一半深度，并用干净的纸巾擦去溢出的石蜡油。

接下来，将无菌纸巾的一角拧成细尖状，用其轻轻吸除MGE细胞沉淀上方多余的培养基。这样可提高细胞密度，从而实现更小的注射体积。

接下来，使用P2移液器缓慢吸取细胞沉淀，并在分配到疏水表面之前轻柔吹打混匀一至两次。体积应略小于1 µL。

将针头尖端插入细胞悬液中，利用液压驱动装置将细胞悬液吸入移液管内。通过低温麻醉幼鼠后，用镊子夹捏其足趾间的皮肤以检查麻醉效果，应无任何反应。

接下来，将幼鼠放置在注射装置下方的模具上，通过向后拉紧头部皮肤并用标准实验室胶带固定，使皮肤绷紧。迅速操作立体定位仪臂，将玻璃移液管的尖端置于幼鼠头部正上方，且与头部表面垂直。

当移液管接触到头部时，将其视为零点。接着，将移液管穿过皮肤和颅骨表面进入皮层。然后，在停止操作前，插入并抽出移液管两次。

为将细胞靶向至新皮层，需在微移液管达到0.1毫米深度时进行注射。针头就位后，旋转液压装置，推动玻璃移液管内的柱塞，每个位点注射50至70纳升。

如果需要在整个新皮层中广泛分布的转化细胞，则在不同前后水平的三到六个不同位点重复此操作。注射完成后，将幼鼠从操作台上取下，并根据批准的程序进行标记。

待幼崽恢复且能够自主活动后，将其放回哺乳雌鼠及其余幼崽中。在手术后及次日检查幼崽，以确保其健康状况无恶化迹象。