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神经科学
0 次观看 • 5:06 分钟 • July 8th, 2025
取含有经生物胞素标记的中间神经元且内源性过氧化物酶已失活的固定并透化的 大鼠海马脑片。
加入含辣根过氧化物酶（HRP）的亲和素-生物素复合物（ABC），孵育，使亲和素与生物胞素结合。
洗去未结合的ABC。
加入显色底物与金属增强剂的混合液，然后孵育。
加入过氧化氢以激活辣根过氧化物酶（HRP），该酶可氧化底物形成深色沉淀，同时增强剂可提高对比度。
将切片转移至滤纸上，去除多余的缓冲液。用四氧化锇处理以增强对比度。
将切片置于载玻片上并封片。使用梯度乙醇浓度进行脱水。
用无水乙醇和环氧丙烷洗涤切片。
加入树脂以浸透组织。
将切片放入样品台中，加热使树脂聚合。将切片转移至载玻片，加盖盖玻片，并固化树脂。
利用光学显微镜观察经生物胞素深染的中间神经元。
将切片放入含有 PBS 的干净玻璃小瓶中。通过首先将切片在亲和素-生物素复合物（ABC）中孵育至少两小时，以扩增 HRP 反应产物，从而进行亲和素 HRP 反应。
接着，用 PBS 洗涤切片 3 次，每次 10 分钟，然后用 Tris 缓冲液洗涤 2 次，每次 10 分钟。除去最后一次残留的缓冲液后，迅速向二氨基联苯胺溶液（即 DAB 溶液）中加入 1 滴 8% 的氯化镍溶液，然后用移液器反复吸打溶液以混匀。
迅速将1毫升该溶液加入切片上。将切片在此溶液中孵育15分钟。然后，向DAB溶液中加入10微升1%过氧化氢。在避光条件下持续振荡反应约1至2分钟，直至细胞被标记。
在通风橱中，将一小片滤纸放入培养皿内，并用 PB 缓冲液润湿。用画笔从玻璃小瓶中逐片取出切片，小心地将其平铺在滤纸上。用另一片湿润的滤纸覆盖切片。然后用纸巾轻轻接触表面，吸去多余的缓冲液。
在滤纸上滴加8至9滴1%的四氧化锇磷酸缓冲液。盖上培养皿，置于通风橱中孵育至少30分钟，但不超过1小时。切片经冲洗、贴片和加盖盖玻片后，依次通过50%、70%、95%和100%的乙醇溶液进行脱水。
脱水步骤完成后，将切片转移至含有100%乙醇的玻璃小瓶中，在摇床上震荡约5分钟。用环氧丙烷替换酒精溶液，洗涤三次，每次5分钟。最后一次洗涤后，保留在小瓶中约2毫升环氧丙烷，并按1:1比例加入树脂。
确保树脂完全溶解，并将切片持续振荡处理30分钟。30分钟后，用木棒将每个切片转移至含有环氧树脂的铝制载片中，过夜孵育。次日，将载片置于加热板上加热约10分钟。
然后，用木棒挑起每个切片，置于干净的载玻片上。待所有切片转移至载玻片后，在解剖显微镜下观察切片方向，并在切片上覆盖盖玻片。于56°C烘箱中孵育48小时以完成固化。