使用寡核苷酸探针进行原位杂交研究大鼠脑切片中的RNA表达

取患有血清素综合征大鼠的固定脑切片，该病症会导致神经元中血清素受体RNA合成发生改变。

使用酒精脱水组织。加入预处理溶液以灭活内源性水解酶，防止其与检测试剂发生相互作用。

使用煮沸缓冲液处理，以破坏固定诱导的交联，从而暴露目标 RNA。

对组织进行脱水，画出疏水屏障，并用溶液孵育以通透细胞膜。

加入寡核苷酸探针并孵育，使探针与目标RNA杂交。

洗涤以去除未结合的探针，然后与扩增试剂孵育，扩增试剂包含能与寡核苷酸探针结合的预扩增剂、扩增剂和酶偶联标记探针。

加入可被酶偶联探针水解的显色底物进行孵育，产生可见的颜色反应。

用二甲苯处理以增加组织透明度，加入封片介质，并加盖盖玻片。

在显微镜下，组织中的彩色斑点有助于定量目标 RNA 的表达水平。

在此步骤中，进行脱水处理时，从存放于负80摄氏度冰箱中的载玻片盒内取出四张载玻片。将组织切片分别分配用于 ppiB、dapB 和 ht2a 基因的检测，并用圆珠笔标记并标注清楚。

接下来，将切片浸入室温的100%酒精中5分钟。然后，在通风橱中干燥切片5分钟。进行预处理时，用移液器向每个切片区段加入20 µL的预处理试剂一。

将切片放置于湿润托盘中的架轨上。在水平摇床上以低速轻轻振荡湿润托盘10分钟。随后，用双蒸水洗涤切片两次，每次两分钟。将切片浸入含有450毫升预处理液2的1,000毫升烧杯中。

接下来，在 100 摄氏度下将载玻片煮沸总共 5 分钟，以恢复 RNA 结构。随后，用双蒸水洗涤载玻片两次，每次 2 分钟。将载玻片置于 100% 酒精中 5 分钟。

然后在通风橱中将载玻片干燥五分钟。使用疏水性笔在组织切片的选定区域周围画一个圆圈。随后，用移液器向每个选定区域加入10 µL预处理试剂，以增强探针的渗透，并用盖子盖上保湿板。

接下来，将托盘放入配备水平摇床的杂交炉中。将炉温设置为 40 摄氏度，轻轻振荡托盘 30 分钟。随后，用双蒸水洗涤载玻片两次，每次两分钟。

在此步骤中，将10微升的ppiB、dapB或htr2a探针移液至选定区域。然后盖上保湿盒盖子，防止试剂蒸发。将切片置于40摄氏度的烘箱中孵育2小时，同时在水平摇床上以低速轻轻振荡。

接下来，用洗涤缓冲液将玻片洗涤两次，每次两分钟。在每个选定区域加入10微升的扩增试剂1。轻轻振荡，并将玻片在40摄氏度下孵育30分钟。然后，用洗涤缓冲液将玻片再次洗涤两次，每次两分钟。

在每个选定区域加入10微升扩增试剂2。轻轻振荡，并将载玻片在40摄氏度下孵育15分钟。随后，用洗涤缓冲液洗涤载玻片两次，每次两分钟。

在每个选定区域加入10微升扩增试剂3。振荡后，将载玻片在40摄氏度下孵育30分钟。然后用洗涤缓冲液洗涤载玻片两次，每次两分钟。

在每个选定区域加入10 µL扩增试剂4。振荡混匀，将玻片置于40 °C孵育15分钟。随后，用洗涤缓冲液洗涤玻片两次，每次2分钟。

在每个选定区域加入10微升扩增试剂5。轻轻振荡，室温孵育载玻片30分钟。随后，用洗涤缓冲液洗涤载玻片两次，每次两分钟。

在每个选定区域加入10微升扩增试剂6。轻轻振荡，将载玻片在室温下孵育15分钟。然后，用洗涤缓冲液再次清洗载玻片，每次2分钟，共洗两次。

现在，向每个选定区域加入10微升红色试剂。将玻片置于水平摇床的湿盒中，在室温下低速轻轻振荡10分钟。然后，用双蒸水洗涤玻片两次，每次10分钟。

将载玻片置于烘箱中，在 60 摄氏度下干燥 15 分钟。随后，将载玻片放入通风橱中的二甲苯中处理五分钟。接着，在每个选定区域滴加 20 微升基于二甲苯的封片介质，并加盖盖玻片。