果蝇脑免疫荧光染色用于神经胶质细胞的单细胞成像

转基因果蝇的大脑开始，其中包含含有细胞特异性重组酶系统的不同神经胶质细胞类型。

它驱动与同一类型细胞上不同抗原表位融合的细胞表面蛋白的表达。

用固定剂处理组织以交联蛋白质并保留组织结构。

清洗以去除多余的固定剂。

添加封闭蛋白以掩盖非特异性结合位点以减少背景染色。

组织与与神经胶质细胞上表达的不同表位结合的一抗混合物孵育。

洗涤以去除未结合的一抗。

与与一抗结合的荧光团偶联二抗孵育。

洗涤以去除未结合的二抗。

大脑安装在成像垫片内并放置盖玻片。垫片为组织创建一个腔室，保留其三维结构。

用不同荧光团偶联抗体标记的相同神经胶质细胞类型的不同细胞可以了解细胞间相互作用。

使用P10移液器吸头将分离的大脑转移到装有固定溶液的200微升微量离心管中。切勿使用镊子处理大脑。孵育避光组织。避免在溶液转移过程中吸出大脑。

要去除固定剂，请用洗涤液洗涤 3 次或更多次 15 分钟。然后，用封闭溶液阻断组织 30 分钟或更长时间。接下来，用在洗涤液中稀释的一抗代替封闭溶液，并将大脑在4摄氏度下孵育过夜。

要去除一抗，请在洗涤液中使用 3 次 1 小时洗涤。接下来，在洗涤液中加入二级荧光团偶联抗体，并将大脑在4摄氏度下孵育过夜，或在室温下孵育4小时。要完全洗掉未结合的抗体，请在洗涤液中使用 3 次 1 小时洗涤，然后用 PBS 洗涤更长时间。

然后，安装大脑。准备两个带有成像垫片的盖玻片。在垫片和额外的盖玻片上，涂上 10 微升含有防褪色剂的封固剂。接下来，使用 P10 移液器将大脑转移到盖玻片上，将它们与一些 PBS 一起沉积在培养基旁边。不要让纸巾变干。

现在，使用移液器小心地将大脑移入封片介质中。最后，将它们移动到垫片中的介质上并用镊子排列它们。然后，取下垫片上的粘合衬垫并贴上盖玻片。使用镊子用轻微压力固定盖玻片，然后立即进行成像。