果蝇大脑的免疫荧光染色用于胶质细胞的单细胞成像

0 次观看3:26 分钟 • July 8th, 2025

从携带不同胶质细胞类型并具有细胞特异性重组酶系统的转基因Drosophila果蝇脑组织开始。

它驱动同一类型细胞表面融合了不同抗原表位的细胞表面蛋白的表达。

使用固定剂处理组织,以交联蛋白质并保持组织结构。

洗涤以去除多余的固定剂。

加入封闭蛋白以封闭非特异性结合位点,从而降低背景染色。

将组织与一抗混合物共同孵育,该混合物可结合胶质细胞上表达的不同表位。

洗涤以去除未结合的一抗。

使用与一抗结合的荧光染料标记的二抗进行孵育。

洗涤以去除未结合的二抗。

将脑组织置于成像间隔垫内,并加盖盖玻片。间隔垫可为组织创建一个腔室,以维持其三维结构。

使用不同荧光染料标记的抗体对同一胶质细胞类型的各个细胞进行标记,有助于理解细胞间的相互作用。

使用P10移液器吸头将分离的脑组织转移至含有固定液的200微升微量离心管中。切勿使用镊子操作脑组织。将组织置于避光条件下孵育。在溶液转移过程中避免吸出脑组织。

为了去除固定剂,使用洗涤液进行三次或更多次、每次15分钟的洗涤。然后,用封闭液对组织进行封闭,时间不少于30分钟。接着,将封闭液替换为用洗涤液稀释的一抗溶液,并在4摄氏度下孵育脑组织过夜。

为去除一抗,使用洗涤液进行三次每次1小时的洗涤。接着,将荧光素标记的二抗加入洗涤液中,4摄氏度孵育脑组织过夜,或在室温下孵育4小时。为彻底洗去未结合的抗体,使用洗涤液进行三次每次1小时的洗涤,随后用PBS进行一次较长时间的洗涤。

然后,封固脑组织。准备两张带有成像间隔垫的盖玻片,在间隔垫内以及额外的盖玻片上,各加入10微升含抗荧光淬灭剂的封片介质。接着,使用P10移液器将脑组织转移至盖玻片上,将其连同少量PBS液滴加在封片介质旁边。注意勿使组织干燥。

现在,使用移液器小心地将脑组织转移至封片介质中。最后,将其移至间隔垫中的介质内,并用镊子进行排列。然后,取下间隔垫上的粘性衬垫,盖上盖玻片。用镊子轻轻施加压力固定盖玻片,并立即进行成像。

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最后更新:29 八月 2026