使用调频染料培养的小脑颗粒神经突触小泡池补充的定量分析
2011年11月11日
描述一个生活的荧光成像技术，量化的补给和动员特定的突触小泡（SV）池，在中央的神经末梢。两轮的SV回收进行监控，在相同的神经终端提供内部控制。
以下实验的总体目标是使用实时荧光成像技术量化中枢神经末梢中特定突触囊泡池的补充和动员。这是通过监测两轮突触小泡循环来实现的，在同一神经末梢使用 FM 染料提供有效的内部对照。作为第二步，使用特定的卸载协议依次耗尽易于释放的池和储备池，这些协议允许量化相对池的大小。
接下来，更改加载或卸载条件，以研究所选变化对突触小泡、池补充或动员的影响。结果表明，基于诱发染料卸载的定量和分析，不同突触物理池的 FM d 负载是可重复的。与现有方法（如流利的遗传报告基因家族）相比，该技术的主要优点是该技术专门跟踪经过内吞作用的突触囊泡对池的补充。
它还允许准确定量。由于该协议在提供内部对照的相同神经末梢执行两次。这种方法可以帮助回答突触、CLE、内吞作用和胞吐作用领域的关键问题，例如特定内吞模式下的作如何影响总回收池和其中突触 CLE 池的补充，例如易于重用的池和储备池。
基本的实验装置应包括倒置落射荧光显微镜、冷却的 CCD 相机、荧光光源、重力灌注装置、带有平行铂电极和电刺激器的成像室以及计算机。在黑暗或红光条件下进行实验，对样品进行最低荧光照射，以避免 FM 染料漂白。通过使用 7 天龄的 spra dolly 大鼠幼崽来准备小脑颗粒神经元的原代培养物来开始此过程。
培养物制备完成后，将神经元接种在多聚 D 赖氨酸包被的 25 毫米盖玻片的中心，滴入直径不超过 7 毫米的液滴中，7 天后向神经元中加入 2 毫升培养基。将单个盖玻片放入室温下的盐溶液中 10 分钟，以便在新培养基中稳定。之后，取下盖玻片，用一小块纸巾或吸水纸擦干其底部和附着细胞周围的区域。
随后，使用硅脂将盖玻片粘到成像室的底部。单元应位于两条平行线之间。使用足够的硅脂完全密封腔室，而不会侵入浴槽的中心。
接下来，用大约 260 微升盐水溶液轻轻填充浴室。然后用相同的溶液填充输入和输出管路。通过将带有硅脂的干净盖玻片粘在顶部来密封腔室。
之后，使用输入和输出管清除腔室中滞留的任何气泡。然后将成像室固定在不锈钢平台中。通过输入管轻轻注入盐水溶液来检查是否有泄漏。
下一步是将组装好的腔室安装在倒置显微镜的载物台上。用盐水溶液灌注重力灌注系统的入口，并将腔室连接到入口。然后将腔室的连接线连接到电刺激器上。
用 1.5 毫升稀释的 fm 染料灌注神经元。随后使用附带的刺激器刺激神经元以诱发染料摄取刺激后，用新鲜生理盐水溶液灌注神经元两分钟以洗去多余的 FM 染料。然后将神经元在盐水溶液中放置 8 分钟。
同时，找到可见单个 FM D 负载神经末梢的轴突网络。使用荧光素波长。避免有细胞簇的区域。
然后在图像采集前立即重新聚焦图像，因为在休息期间可能会出现轻微的漂移。以每 4 秒 1 帧的速率开始延时图像采集。在获取 5 到 10 张基线图像后，通过提供 30 赫兹的刺激 2 秒来唤起易于释放的池的胞吐作用。
在获取另外 10 张图像后，唤起突触囊泡，使用 3 次 40 赫兹刺激储备池的胞吐作用，持续 10 秒，刺激之间间隔 40 秒，再获取 5 到 10 张图像。然后暂停图像采集。让神经元恢复至少 20 分钟，并在 S 第二阶段再次重复此 S 一期方案以进行对照实验。
对于数据分析，请将图像转换为堆栈。使用图像 J 内置功能，然后调整堆栈的亮度和对比度，以便在发生明显的水平漂移时最大化动态范围。在实验期间，在图像 J 上运行 stack reg 和 turbo reg 插件以对齐图像堆栈。
然后是 runtime series analyzer 插件。接下来，定义至少 90 个神经末梢的感兴趣区域。在模具卸载之前和之后在图像之间切换以揭示活跃的神经末梢是有帮助的。
理想的感兴趣区域大小是比典型神经末梢略大的区域。然后获得每个感兴趣区域随时间变化的总荧光强度。之后，导出到 Microsoft Excel。
这里显示的是对照实验的流程图，其中小脑颗粒神经元使用 80 赫兹 10 秒刺激加载 10 微摩尔 FM 1 43。这是一张显示加载 FM 1 43 的神经末梢的图像。这是相同的图像，显示了在识别活动神经末梢后选择用于分析的 90 个编号感兴趣区域，这些是选定时间点的神经末梢图像。
这些图像以伪彩色呈现，以说明不同突触囊泡池耗尽时荧光的变化。最后，这里显示了这 90 个神经末梢的归一化荧光单位。在 S 1 和 S 2 期中，可以测量每个连续刺激的荧光下降，并在 S 1 和 S 2 期之间进行比较。
在这个对照实验中，S 1 和 S 2 都导致了相同大小的易释放池和储备池。看完这个视频，你应该对如何使用生命荧光成像技术量化中枢神经末梢中特定突触囊泡池的补充和动员有一个很好的了解。在尝试此程序时，重要的是要记住在改变 S 两个实验条件之前通过执行 S one 对照实验来确认细胞活力和反应性。
概述
本文描述了一种活体荧光成像技术，用于定量分析中枢神经末梢特定突触小泡（SV）池的补充和动员。该方法允许监测同一神经末梢中的两轮SV循环，提供了内部控制以实现准确的定量分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 成像技术
背景
- 理解突触小泡动力学对于洞察神经传递至关重要。
- 活体成像技术增强了实时研究突触过程的能力。
- 之前的方法缺乏有效跟踪特定小泡池的能力。
- 本研究旨在通过提供内部控制来改进现有技术。
研究目的
- 定量分析突触小泡池的补充和动员。
- 监测同一神经末梢中的两轮突触小泡循环。
- 评估不同装载和卸载条件对小泡动力学的影响。
使用的方法
- 使用FM染料进行活体荧光成像以可视化突触小泡。
- 使用特定协议对可随时释放和储备池进行顺序耗竭。
- 使用时间连拍成像捕捉刺激过程中的小泡动力学。
- 使用图像处理软件分析数据以定量荧光强度。
主要结果
- 该技术允许可重复地跟踪突触小泡的装载和卸载。
- 内部控制增强了获得结果的有效性。
- 内吞模式的操作显著影响小泡补充。
- 定量分析揭示了对突触小泡池大小的洞察。
结论
- 该方法提供了一种可靠的方法来研究突触小泡动力学。
- 它为回答突触生理学的关键问题提供了潜力。
- 研究结果可能影响未来关于神经传递和突触可塑性的研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables precise quantification of synaptic vesicle pool dynamics, supporting mechanistic de-risking in target validation for neurodegenerative disease programs. By providing internal controls and differential pool analysis, it enhances predictive confidence in early discovery stages where vesicle trafficking mechanisms are therapeutic targets. The approach addresses variability across preparations, improving reproducibility for cross-functional collaboration in assay development pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of synaptic vesicle trafficking pathways to validate targets involved in neurotransmitter release and recycling.
- Operational Value: Provides quantitative, reproducible measurements of readily releasable and reserve pool replenishment under varying stimulation conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates assay-ready readouts of vesicle mobilization kinetics that can be used to screen compounds affecting endocytosis or exocytosis.
- Operational Value: Uses FM dye labeling to produce quantal fluorescence signals proportional to vesicle release, enabling standardized, quantitative screening formats.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant modeling by quantifying how manipulations of endocytosis modes affect specific vesicle pools in cerebellar granule neurons.
- Operational Value: Enables within-preparation comparisons (S1 vs S2 phases) to control for biological variability, increasing assay reliability in preclinical studies.
Pipeline & Workflow Integration
The technique fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, where understanding vesicle pool dynamics informs mechanism of action and compound effects on presynaptic function.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on how endocytosis pathways (e.g., clathrin-dependent vs activity-dependent bulk endocytosis) regulate vesicle pool mobilization.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs (fluorescence decay kinetics) that enable comparison of compound effects on vesicle recycling.
- Analytics: Provides time-resolved fluorescence intensity measurements from regions of interest, allowing calculation of pool-specific replenishment rates.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by using disease-relevant neuronal models to assess how genetic or pharmacological perturbations alter vesicle trafficking.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized imaging workflow that can be adapted across neuronal models and stimulation paradigms for repeated use in discovery campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by isolating the contributions of specific synaptic vesicle pools to neurotransmission dynamics.
- Operational Value: Enhances reproducibility through internal controls (dual-phase measurements in same nerve terminals) and standardized FM dye protocols.
- Strategic Value: Reduces mechanistic ambiguity in presynaptic target validation, supporting better go/no-go decisions in early discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on effects on vesicle pool replenishment, a key presynaptic mechanism.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live fluorescence imaging and neuronal culture preparation, particularly for primary cerebellar granule neurons.
- Depends on inverted epifluorescence microscopy, cooled CCD camera, electrical stimulation, and perfusion systems for precise solution exchange.
- Necessitates standardization of staining, washing, and stimulation timing across runs to ensure comparable vesicle loading and unloading.
- Must account for variability in nerve terminal density and health, addressed by selecting active terminals and using internal controls.
- Limited to optically accessible preparations; not suitable for high-throughput formats without automation of imaging and analysis.
