在不同硬度水凝胶上培养的神经嵴细胞的荧光染色

取培养在不同硬度水凝胶包被的盖玻片上的贴壁神经嵴细胞培养物，用缓冲液洗涤细胞。

加入多聚甲醛以固定细胞并保持细胞形态。

用缓冲液洗涤细胞，以去除多余的多聚甲醛。

接着，加入非离子型去污剂以透化细胞膜。

用缓冲液洗涤细胞，以去除多余的去垢剂。

然后，加入封闭溶液以防止非特异性结合。

使用一种高亲和力的丝状肌动蛋白探针孵育细胞，该探针可结合肌动蛋白丝。

用缓冲液洗涤细胞，以去除未结合的探针。

加入荧光核染料以染色细胞核，然后用缓冲液洗涤以去除多余的染料。

滴加封片剂至盖玻片上，并在荧光显微镜下观察染色后的细胞。

在较硬的水凝胶上培养的细胞比在较软的水凝胶上培养的细胞表现出更强的肌动蛋白丝形成和更伸展的形态。

使用镊子将盖玻片转移至新培养板，以尽量减少直接在培养板上生长的细胞产生的假信号。随后，加入 500 µL 4% 多聚甲醛固定细胞 10 分钟，再于室温下用 500 µL 0.1% Triton X-100 处理细胞。

孵育15分钟后，用250微升含10%驴血清的溶液封闭细胞。在250微升含10%驴血清的溶液中，将鬼笔环肽按1:400稀释后对F-肌动蛋白进行染色，随后加入DAPI孵育10分钟。

用 PBS 清洗细胞 2 分钟，然后向每个孔中加入 3 至 4 滴封片剂。在荧光显微镜下，对每种水凝胶样品至少采集三个随机视野的图像，包括单独通道和合并通道。