评估运动神经元中的葡萄糖摄取 果蝇 葡萄糖代谢上调的幼虫

将对照组和突变型 Drosophila 幼虫分别放入含有无葡萄糖缓冲液的不同培养皿中。

解剖幼虫以去除内脏器官，暴露中枢神经系统（CNS）。

中枢神经系统包括一条腹神经索，其中含有运动神经元。在突变型幼虫中，这些神经元表现出葡萄糖代谢的上调。

两组中的运动神经元均表达含有供体和受体荧光团的细胞内葡萄糖传感器。

将幼虫置于共聚焦显微镜下。激发后，供体荧光团发出荧光。

利用这种荧光定位运动神经元。

用添加葡萄糖的溶液替换缓冲液。

葡萄糖进入神经元，与传感器结合并触发构象变化，使两个荧光基团相互靠近。

激发后，受体吸收供体发射的能量，这一过程称为荧光共振能量转移（FRET），并发出荧光。

FRET 信号与葡萄糖摄取相关。与对照组相比，突变型幼虫中更高的受体信号强度表明葡萄糖代谢上调。

开始解剖前，先打开成像显微镜和激光器。然后，取一只游走期三龄幼虫，用双蒸水冲洗，并将其放入已预先准备好的弹性体衬里培养皿中的 HL3 缓冲液滴内。

接下来，在解剖显微镜下，用一对镊子轻轻拉伸幼虫，使其背面向上，并用昆虫针将幼虫的前端和后端固定。使用一对斜角虹膜剪，在后端针孔稍上方处做一切口，然后从该切口沿垂直方向向前端进行剪切。

如有需要，加入几滴 HL3 缓冲液后，去除气管及其他漂浮的器官，注意不要破坏中枢神经系统。然后用大头针固定两侧组织瓣，拉伸体壁，以暴露中枢神经系统，同时保持神经肌肉系统的完整性。

进行图像采集时，使用配备40倍水浸物镜的正置共聚焦显微镜。然后选择405纳米激光激发CFP。接着优化采集参数，如扫描速度、平均次数、物镜、缩放倍数、针孔大小和空间分辨率。调节增益，使信号处于最佳动态范围，并对所有基因型使用相同的参数。

为了对腹神经索内的运动神经元进行成像，将装有已解剖样本的硅胶培养皿置于物镜下，并降低物镜，使其接触海藻糖-蔗糖HL3溶液。确保物镜完全浸没在缓冲液中，必要时可添加更多缓冲液。

接下来，使用 CFP 和 FRET 通道，手动选择至少 6 个位于腹神经索中线、处于焦平面内的运动神经元作为光学选区。然后，每隔 10 秒或 10 分钟采集一次图像。这些图像代表基线水平。

进行葡萄糖刺激时，使用巴斯德吸管移除含有海藻糖和蔗糖的HL3缓冲液，并在不移动腹神经索的情况下，加入含5毫摩尔葡萄糖的HL3缓冲液。然后，每10秒采集一次图像，持续10分钟。

这些图像代表刺激阶段。将图像保存为 dot czi 文件，或任何成像软件支持的文件格式，文件名需包含日期、遗传背景、实验条件以及所使用的通道。使用相同的参数对所有基因型进行成像。