小鼠脑组织切片中荧光标记星形胶质细胞的免疫染色

取一包含稀疏表达荧光蛋白的星形胶质细胞的固定小鼠脑组织切片。

使用含有去污剂的缓冲液处理游离切片，以通透细胞。

将切片置于封闭缓冲液中孵育，以防止非特异性抗体结合。

使用一抗处理切片，并进行孵育，使抗体与星形胶质细胞中的荧光蛋白结合。

使用缓冲液洗去多余的初级抗体。

接着，将切片与荧光标记的二抗孵育，二抗可与一抗结合。

用缓冲液洗去未结合的二抗。

将切片转移至缓冲去离子水混合液中，以去除去污剂残留物。

将切片置于载玻片上含有缓冲去离子水的液滴中。去除多余液体后加入封片剂，然后盖上盖玻片并固定。

最后，使用共聚焦显微镜观察切片中标记的表达荧光蛋白的星形胶质细胞。

首先，通过将1毫升10%的Triton X加入50毫升离心管中，并用TBS定容至50毫升，配制新鲜的TBST溶液。为每份脑组织准备2毫升封闭液和抗体溶液，方法是在15毫升离心管中将山羊血清与TBST混合。

接下来，标记一个24孔板，将不同样品置于不同行，不同溶液置于不同列。然后，向标记为“Wash 1”、“Wash 2”和“Wash 3”的前三列每列加入1毫升TBST，并向第四列加入1毫升封闭液。

使用本生灯将一支5.75英寸的巴斯德移液管末端熔成一个小钩，制备成玻璃挑针。然后用该挑针将组织切片从12孔板转移至24孔板的“洗涤1”列中。接着用玻璃挑针将切片依次从一个孔转移至下一个孔，分别在洗涤1、2和3孔中各洗涤10分钟，随后将切片在封闭液中孵育1小时。

接下来，在4摄氏度下将切片与一抗孵育两到三个晚上，同时进行振荡。一抗孵育结束后，吸除洗涤孔中的第一天TBST溶液。然后向每个洗涤孔中加入1毫升新鲜TBST溶液，并将切片转移至第一个洗涤孔中。

接着，将切片在室温下与二抗孵育三小时。二抗孵育结束后，吸去第二天的TBST缓冲液。然后向每个洗涤孔中加入1毫升新鲜TBST缓冲液，并将切片转移至第一个洗涤孔中。

在最后一次洗涤过程中，将封片介质从 4 摄氏度取出，使其升至室温。然后，用去离子水配制 TBS 的 2:1 混合液，并加入培养皿中。接着，在载玻片表面加入 800 微升去离子水中的 TBS 2:1 混合液，以制备显微镜载片。

将切片从“洗涤3”孔转移至培养皿中。然后，使用细毛笔将切片逐个从培养皿转移至载玻片的液体上。接着，用毛笔小心地将切片展平，使其完全贴附于载玻片表面。随后，先用 P1000 移液器吸除载玻片上多余的液体，再进行真空抽吸。

当玻片上所有多余的液体去除后，立即使用移液管向每个组织区域滴加一滴封片剂，并轻轻盖上盖玻片。静置数分钟使封片剂充分扩散，然后用真空抽吸法除去从盖玻片边缘溢出的多余封片剂。随后，用透明指甲油密封盖玻片的四个边缘。