激光捕获显微切割法从人死后小脑组织中分离浦肯野细胞

取含浦肯野细胞层、颗粒细胞层和分子细胞层的人类死后小脑组织。

将其置于含有部分冷冻包埋介质的冷冻切片机样本架上。

让培养基完全冻结，以固定组织。

将此组装物转移至冷冻切片机的切片臂中，并使组织适应冷冻切片机的温度。

将组织移近刀片，并修整以暴露皮质层。

在刀片上方放置一块防滚动板，并获取小脑切片。

将这些切片转移至膜片上。

用浓度递增的乙醇孵育以进行组织固定和脱水。

然后，在二甲苯中孵育。

将玻片干燥后置于紫外激光显微切割仪的载物台上。

将收集帽置于小脑组织上方。

在显微镜下，重点关注浦肯野细胞。

使用激光捕获并收集浦肯野细胞，用于进一步分析。

首先，切取一小块用于切片的组织，确保切片中约95%为小脑皮层。将剩余组织放回干冰或-80摄氏度的冰箱中。接着，以缓慢的环形动作将OCT包埋剂逐滴加至样本头表面。持续添加OCT，形成覆盖样本头、高度约三毫米的圆顶状小丘。

当OCT部分冻结但仍中心留有液体时，将组织置于其表面的隆起处。让组织在OCT上静置1至2分钟，直至完全冻结。随后，将带有冻结OCT和组织的样本头转移至冷冻切片机的切片臂中。调整组织位置，使其与切片刀刃齐平，并让组织在切片臂中静置20分钟，以适应新的温度。

最关键的步骤是让组织在冷冻切片机的切片臂中充分适应，所需时间应视情况而定。如果组织发生碎裂，浦肯野细胞的观察将变得非常困难。建议使用更小、更薄的组织块，以加快组织的适应速度。

此后，缓慢将组织移近刀片。当组织到达刀片时，开始修块过程。修块 2 到 3 次，直至皮层结构可见。

接下来，将抗卷板放置在冷冻切片机刀片正上方并进行对齐。切取4到6片厚度为14微米的切片，注意切片若在抗卷板下保持平整，表明切割良好。将切下的切片在冷冻切片机载物台上水平对齐排列。

同时倾斜载玻片以拾取所有组织碎片。在切片完成后立即把载玻片放入盛有冰上预冷的70%乙醇的载玻片架中，孵育2分钟。随后将载玻片转移至盛有冰上预冷的95%乙醇的载玻片架中，孵育45秒。

接下来，将载玻片放入盛有100%乙醇的染色缸中，在室温下放置2分钟。将载玻片在室温下浸入含有二甲苯1号的染色缸中，上下浸没3次。然后，将载玻片放入盛有二甲苯2号的染色缸中，在室温下放置5分钟。将载玻片竖直放置于洁净的通风橱中，使其空气干燥至少30分钟。

首先，使用RNase去污染剂清洁收集臂中的显微镜载物台。戴手套后，将载玻片放置在显微镜上，并在收集臂中放入一个500 µL不透明帽。在低倍镜下，将不透明帽对准小脑组织，确保该帽覆盖目镜中所见的整个区域。

使用5至10倍物镜观察小脑各层结构。将光标移至分子层与颗粒细胞层交界处。切换至40倍放大倍数，观察浦肯野细胞，随后开始采集图像。