0 次观看 • 3:55 分钟 • July 8th, 2025
解冻一段冷冻的大鼠脑组织。
加入缓冲液并切碎组织。然后将其转移至含有缓冲液的离心管中并混匀。
离心混合物并弃去上清液。
向组织中加入蛋白水解酶溶液，并使用大口径移液管将其重悬。
孵育混合物以降解细胞外基质，使神经细胞松散。
离心混合物，并弃去上清液。
将组织碎片重悬于预冷的缓冲液中，并反复吹打以解离细胞。
静置，使碎片和未解离的细胞沉淀，然后将单细胞悬液转移至新管中。
将细胞转移至预冷的乙醇中并混匀。孵育以固定和通透细胞。
离心该悬浮液，并弃去上清液。
将神经细胞重悬于冷缓冲液中，用于进一步分析。
为切碎组织，将样本置于冰冷的玻璃板上，解冻时间不得超过1分钟，随后在样本上覆盖一至两滴缓冲液A。接着，将剃刀刀片完全垂直于玻璃板，分别在每个正交方向上切碎组织100次。为充分切碎组织，关键是要始终保持组织被缓冲液A润湿，并严格遵循规定的切碎次数和方向。
在组织解剖过程中，必须去除大部分白质，并始终保持组织浸没在缓冲液A中，以提高剪切效率并维持细胞活性。
当组织完全处理完毕后，使用刀片将组织块转移至含有 1 毫升冷缓冲液 A 的微量离心管中，并将管子上下颠倒 3 到 5 次，使所有剪碎的组织完全浸入溶液中。为将组织碎片解离成单细胞悬液，通过离心使样品形成沉淀。
弃去上清液，然后沿微量离心管内壁缓慢加入1毫升冰冷的、 freshly thawed 酶溶液，使用大口径吸头立即吸取并排液，将每个沉淀物反复吹打4次，以分散剪碎的组织块。接着，迅速倒置微量离心管，防止沉淀物贴附于管底，并在4°C下以翻转混匀方式孵育样品30分钟。
消化结束后，再次离心试管，并向细胞中加入 0.6 毫升预冷的缓冲液 A。使用同一枪头立即吹打沉淀物 5 次，然后更换 1.3 毫米玻璃移液管，轻柔吹打样品 10 次。
将样品置于冰上 2 分钟，使碎片和未解离的细胞沉降到管底。然后，将上清液转移至新的 15 毫升离心管中。接着，从收集的上清液第一管中取出 800 微升细胞悬液，分别加入到两管乙醇中。
将试管倒置以混匀样品。然后将样品置于冰上孵育15分钟，每5分钟倒置混匀一次。孵育结束后，离心细胞。随后仅接触微量离心管管壁，用移液器缓慢吸除上清液，每管保留最后50微升。